楊美蓮，樊志峰，蔡圣寶，曹建新，程桂廣，趙天瑞

(昆明理工大學(xué) 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

桑葚是?？坡淙~喬木桑樹(shù)(MorusalbaLinn)的果實(shí)，在大多數(shù)國(guó)家均有紅桑(Morusrubra)、黑桑(Morusnigra)和白桑(Morusalba)，由于其味道鮮美，色澤悅目，熱量低和營(yíng)養(yǎng)高[1]，通常加工成果酒、果汁和果醬[2].桑葚中富含氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)、多酚和多糖等生物活性物質(zhì)[3]，常用于退燒，治療喉嚨痛，肝腎保護(hù)，改善視力和降低血壓等[4].桑葚藥理研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)提取物具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗肥胖作用、預(yù)防心血管疾病、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓形成、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性等生物活性[5-7].

花青素是桑葚中主要的多酚，含量高于藍(lán)莓、黑莓、黑加侖和紅醋栗[8].花青素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-蕓香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷和天竺葵素3-O-蕓香苷是桑葚中的主要花青素[9].花青素不僅是是桑葚顏色的主要來(lái)源，同時(shí)也是其促進(jìn)健康的關(guān)鍵成分[10].丁樂(lè)等[11]研究發(fā)現(xiàn)桑葚花色苷粗提物高中劑量組能降低心肌線粒體中MDA含量，升高心肌線粒體中SOD量，較低劑量組和正常組具有顯著性差異(P<0.05)，對(duì)小鼠常壓缺氧和心肌缺血實(shí)驗(yàn)具有保護(hù)作用.裴蕾等[12]研究發(fā)現(xiàn)桑葚花色苷提取物可以改善由高脂酒精膳食所引起的小鼠棕色脂肪組織的形態(tài)學(xué)改變和功能抑制，可防治慢性代謝性疾病.

近年來(lái)，人們開(kāi)展了許多對(duì)桑葚活性成分及藥理作用的相關(guān)研究，為桑葚資源的高效利用和相關(guān)功能性生物制品的研制開(kāi)發(fā)以及桑葚功能食品的開(kāi)發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ).本研究探討了桑葚花色苷的最佳提取工藝條件，并評(píng)價(jià)其純化前后的抗氧化能力，為得到更多的桑葚花色苷資源提供有利的參考.

1 材料儀器和方法

1.1 材料和儀器

桑葚樣品2017年2月購(gòu)自于四川成都，經(jīng)冷凍干燥后打粉過(guò)0.216 mm篩備用.

甲醇、乙醇、丙酮、乙腈：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；碳酸鈉：四川西隴化工有限公司；TPTZ、DPPH、ABTS、福林酚試劑、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(分析純)購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司；大孔吸附樹(shù)脂：AB-8、NKA-9、NKA-2、HPD-100、XAD-16、HPD-750購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司，LSD-296、LSD-762購(gòu)于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；蒸餾水(自備).

電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；AS10200BT型超聲波清洗儀：天津市奧特賽恩斯儀器有限公司；TGL20B型高速旋轉(zhuǎn)離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海愛(ài)郎儀器有限公司；UV-5100BPC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；pH計(jì)：上海闊思電子有限公司.

1.2 方法

1.2.1 花色苷的提取

準(zhǔn)確稱取1 g桑葚粉末加入不同的酸化有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑調(diào)節(jié)pH至酸性，以減少花色苷的分解)，在不同條件下進(jìn)行超聲輔助提取桑葚花色苷.用離心機(jī)以10 000 r/min離心10 min，取上清液濃縮成浸膏，稱重，待用.

1.2.2 花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法對(duì)桑葚花色苷含量進(jìn)行測(cè)定[9, 13].

pH=1.0的緩沖溶液制備：準(zhǔn)確稱取1.117 5 g KCl粉末用蒸餾水定容500 mL,用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)至pH=1.0.

pH=4.5的緩沖溶液制備：準(zhǔn)確稱取5.4 g乙酸鈉粉末，用蒸餾水定容至100 mL，用乙酸溶液調(diào)節(jié)至pH=4.5.

取0.5 g樣品浸膏加一定溶劑稀釋成待測(cè)樣液，取1 mL待測(cè)溶液加到9 mL pH 1.0的緩沖液中，分別于520和700 nm處測(cè)定吸光值.另取1 mL待測(cè)液加到pH 4.5的緩沖液中，分別于520和700 nm處測(cè)定吸光值.根據(jù)如下公式(1)計(jì)算出花色苷含量.

桑葚樣品中花色苷含量為：C(mg/L)=A×MW×DF×1000/(ε×l).

(1)

其中A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5,(A510-A700)pH 1.0為加pH 1.0緩沖液的樣液在510和700 nm波長(zhǎng)下的吸光值之差；(A510-A700)pH 4.5為加pH 4.5緩沖液的樣液在510和700 nm波長(zhǎng)下的吸光值之差；MW=449.2(矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的分子量，mg/mol)；DF=樣液稀釋的倍數(shù)；ε=26 900(矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，mol-1)；l=比色皿的光路直徑，為1 cm.

1.2.3 桑葚花色苷提取工藝的優(yōu)化

1)單因素試驗(yàn).分別考察溶劑種類(lèi)(水、70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮)，pH值(pH=1、2 、3 、4 、5)；甲醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%)；料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL))；提取時(shí)間(30、60、90 min)；提取次數(shù)(1、2、3)對(duì)桑葚花色苷提取率的影響.

2)正交試驗(yàn).在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(33)對(duì)桑葚花色苷提取條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，設(shè)置3因素(甲醇體積分?jǐn)?shù)A、料液比B和提取時(shí)間C)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，重復(fù)3次，具體見(jiàn)表1.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 大孔樹(shù)脂篩選

參考文獻(xiàn)[14-15]，大孔樹(shù)脂用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌，并不斷攪拌，以除去氣泡，充分溶脹，靜置24 h后，用蒸餾水清洗到無(wú)醇味待用.

1)桑葚粗提液的制備.利用正交實(shí)驗(yàn)最佳提取工藝條件對(duì)桑葚花色苷進(jìn)行提取，即稱取一定量的桑葚粉末，在pH=1.0的條件下，用70%甲醇，料液比1∶55(g/mL)，超聲提取60 min，得到桑葚花色苷的粗提液.

2)靜態(tài)吸附與解析.準(zhǔn)確量取經(jīng)預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂2.000 g，置于三角瓶中，準(zhǔn)確加入一定體積的粗提液，室溫下中速振蕩24 h，至吸附平衡.將吸附平衡的樹(shù)脂置于具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入一定體積的70%乙醇溶液，室溫下中速振蕩24 h，然后將樹(shù)脂濾出，分別測(cè)定兩者洗脫液中桑葚多酚及花色苷的濃度.按(2)式計(jì)算吸附量、吸附率和解吸率：

Q=(C0-C1)V1/W,A=[(C0-1)/C0]×100%,D=[(C0-1)V1/C2V2]×100%.

(2)

式中：Q為吸附量(mg/g)，C0為起始濃度(mg/mL)，C1為平衡濃度(mg/mL)，V1為吸附液體積(mL)，W為樹(shù)脂重量(g)，A為吸附率(5%)，D為解吸率，C2為洗脫液濃度(mg/mL)，V2為洗脫液體積.

1.2.5 抗氧化能力的測(cè)定

1)DPPH·清除能力的測(cè)定.參照文獻(xiàn)[16-17]，略作改動(dòng).取0.5 mL不同濃度的純化前后樣品溶液和2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混合，搖勻，避光反應(yīng)30 min后，以無(wú)水乙醇為空白，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度.以對(duì)DPPH·的清除率達(dá)50%時(shí)(IC50，mg/mL)所需要的樣品質(zhì)量濃度來(lái)比較不同溶劑提取液對(duì)DPPH·清除能力的大小.DPPH·清除率按公式(3)計(jì)算.

(3)

其中：T0空白對(duì)照組吸光值(0.5 mL甲醇 + 2.0 mL DPPH工作液);Tx0樣品對(duì)照組吸光值(0.5 mL樣品 + 2.0 mL甲醇);Tx樣品吸光值(0.5 mL樣品 + 2.0 mL DPPH工作液).

2)ABTS+·清除能力的測(cè)定.參照文獻(xiàn)[18-19]，略作改動(dòng).將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 40 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，置于暗處反應(yīng)12 h，得到ABTS+·儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇將ABTS+·溶液稀釋使其在734 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度為0.70±0.02.將0.5 mL不同濃度的純化前后桑葚花色苷提取物溶液與4 mL ABTS+·溶液中均勻混合，水浴6 min后，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值.按如下公式(4)進(jìn)行計(jì)算.

(4)

其中：X0空白對(duì)照組吸光值(：0.5 mL乙醇+ 4.0 mL ABTS工作液);X1樣品對(duì)照組吸光值(：0.5 mL樣品+ 4.0 mL乙醇);X2樣品吸光值(：0.5 mL樣品+ 4.0 mL ABTS工作液).

3)鐵離子還原力的測(cè)定.參照文獻(xiàn)[19-20]，略作改動(dòng).取0.5 mL稀釋成不同濃度梯度的純化前后的樣品于5 mL離心管中，加入4.5 mL預(yù)熱的FRAP溶液(將300 mmol/L pH 3.6醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的比例混合，30 ℃水浴10 min備用)，充分混勻后，30℃水浴10 min，在593 nm處測(cè)定吸光值(用0.5 mL甲醇進(jìn)行調(diào)零).

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為均值±方差，采用Origin 8.5繪圖軟件繪圖，SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行Duncans差異分析，P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖a所示，用70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮以及水按1∶30(g/mL)的料液比分別在同一條件下提取30 min后，按照1.2.2的方法測(cè)定花色苷提取率.結(jié)果顯示提取效果由好到差依次是70%甲醇>水>70%乙醇>70%丙酮.故選擇提取溶劑為70%甲醇.

圖b所示，用50%、60%、70%、80%、90%甲醇按1∶30(g/mL)料液比在相同條件下提取30 min，計(jì)算得桑葚花色苷提取率，結(jié)果顯示當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)從50%上升到70%時(shí)，花色苷提取率逐漸增大，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，提取效率略微下降，這可能與花色苷極性大小有關(guān)系.因此選擇最適提取溶劑為70%甲醇.

圖c所示，用70%甲醇按料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)在同一條件下進(jìn)行提取，結(jié)果顯示隨著料液比的增加，花色苷提取率在不斷增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶60時(shí)，提取率達(dá)到最大值，再增加料液比時(shí)，花色苷提取率降低.因此從提取效果和經(jīng)濟(jì)條件綜合考慮，最適料液比為1∶60(g/mL).

圖d所示，同時(shí)用70%甲醇按料液比1∶60(g/mL)在同一條件下分別超聲提取30、60、90 min，結(jié)果顯示超聲時(shí)間在30～60 min內(nèi)，多酚提取率逐漸增大，但超過(guò)60 min后多酚提取率略有降低，可能因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致溫度升高，破壞了花色苷的分子結(jié)構(gòu)，從而引起花色苷得率下降[21].因此，最適超聲時(shí)間為60 min.

圖e所示，分別用pH=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0的70%甲醇下，以料液比為1∶60(g/mL)進(jìn)行超聲提取60 min得到的桑葚花色苷提取率.結(jié)果顯示，在pH=1.0的條件下桑葚花色苷提取率達(dá)到最大值，而pH逐漸增大提取率呈現(xiàn)減小性的波動(dòng).可能的原因是花色苷本身不穩(wěn)定，在一般條件下極易分解，因此最適pH宜選pH=1.0.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)下表2，方差分析見(jiàn)表3.

表2 花色苷正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(33)結(jié)果直觀分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

注：查表得F0.05(2,4)=4.46，F(xiàn)0.01(2,4)=8.65; 當(dāng)F比>F0.01時(shí)，有極顯著差異，用**表示；當(dāng)F比>F0.05時(shí)，有顯著性差異，用*表示.

由極差結(jié)果分析可知RB>RC>RA，因此影響桑葚花色苷提取率的主次因素為料液比>提取時(shí)間>甲醇體積分?jǐn)?shù).各因素對(duì)于提取效率來(lái)說(shuō)沒(méi)有顯著性差異，綜合指標(biāo)最優(yōu)組合是A2B1C2，即在固定超聲波的條件下，桑葚花色苷最佳提取工藝條件為70%甲醇、料液比1∶55(g/mL)、提取時(shí)間60 min，該條件下桑葚多酚提取率為6.497%.

2.3 大孔樹(shù)脂純化

花色苷吸附量與樹(shù)脂極性、樹(shù)脂比表面積有關(guān).大孔樹(shù)脂對(duì)桑葚花色苷的吸附不僅是利用多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及高比表面積形成的分子篩作用，而且與樹(shù)脂和花色苷物質(zhì)之間的范德華力或氫鍵有關(guān)，樹(shù)脂的孔徑對(duì)花色苷的吸附效果影響較大，孔徑過(guò)小或過(guò)大都不利于花色苷分子的保留[22].由以上數(shù)據(jù)可知，NKA-2型大孔樹(shù)脂有最好的吸附能力，其次依次為L(zhǎng)SD-296>NKA-9>HPD-750>HPD-400，而AB-8型樹(shù)脂對(duì)樣品的吸附作用不強(qiáng)，吸附率僅為35.61%，而從吸附樣品的解析情況，其解析率大小依次為AB-8>HPD-400>NKA-9>HPD-750>NKA-2> LSD-296.綜合考慮吸附和解吸效率兩個(gè)指標(biāo)，選取各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)較高的NKA-9型大孔樹(shù)脂純化桑葚花色苷.

純化前桑葚花色苷的含量為6.49 mg/g，純化后樣品的花色苷含量達(dá)到10.38 mg/g，說(shuō)明NKA-9型樹(shù)脂純化桑葚花色苷工藝效果較為明顯，有一定的實(shí)用性，具體結(jié)果如下圖所示.

2.4 純化前后抗氧化結(jié)果

桑葚花色苷純化對(duì)Fe3+還原力、DPPH·和ABTS+·的清除活性情況如下表4所示.

抗氧化活性的測(cè)定具有多種機(jī)制，如清除活性氧、抑制脂質(zhì)氧化等，同一種樣品中會(huì)有多種抗氧化物質(zhì)同時(shí)存在，在一定程度上會(huì)出現(xiàn)協(xié)同抗氧化作用.抗氧化活性受多種因素影響，因此，對(duì)于同一個(gè)樣品，應(yīng)采用3種及其以上抗氧化方法綜合評(píng)價(jià)抗氧化活性[23].本文采用DPPH·、ABTS+·的清除能力以及對(duì)Fe3+還原能力的測(cè)定3種方法來(lái)評(píng)價(jià)桑葚花色苷純化前后抗氧化活性的變化情況.

表4 粗提物和純化后桑葚花色苷提取物對(duì)Fe3+還原力、DPPH·和ABTS+·的半抑制質(zhì)量濃度

結(jié)果以IC50值來(lái)表示.IC50越小，抗氧化劑清除自由基的能力越強(qiáng)[24].由表4可知，桑葚花色苷具有一定的抗氧化能力，且經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后的花色苷由于除去對(duì)自由基沒(méi)有清除作用的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)和部分有機(jī)物使得抗氧化能力明顯高于純化前桑葚花色苷，純化前花色苷對(duì)于Fe3+還原能力、DPPH+·、ABTS+·自由基的IC50分別為0.825、0.318、0.817 mg/mL，而純化后桑葚花色苷對(duì)于Fe3+還原能力IC50值為0.126 mg/mL，比純化前提高了6.55倍，DPPH+·自由基清除能力提高了1.94倍，而ABTS+·自由基相對(duì)于純化前提高了3.54倍.但相對(duì)于抗壞血酸(IC50值分別為0.012、0.012、0.018 mg/mL)來(lái)說(shuō)，桑葚花色苷的抗氧化性能略遜，但作為一種天然抗氧化劑，桑葚提取物均具有良好的自由基清除活性，可作為良好的抗氧化劑來(lái)源.

3 結(jié)語(yǔ)

本研究采用正交試驗(yàn)考察提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比以及時(shí)間對(duì)桑葚花色苷提取率的影響，確定其最佳提取工藝參數(shù)為70%甲醇、料液比1∶55(g/mL)、提取時(shí)間60 min，該條件下桑葚花色苷提取率為6.497%.通過(guò)6中不同極性大孔樹(shù)脂吸附和解析效率比較，確定NKA-9 型樹(shù)脂為桑葚花色苷的最佳純化樹(shù)脂.綜合DPPH+·、ABTS+·自由基清除活性以及FRAP法對(duì)桑葚花色苷提取物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性明顯，可作為良好的天然抗氧化劑來(lái)源.為桑葚作為天然抗氧化劑的提取和開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ).