魯瑞娟 許秋梅

(紹興文理學(xué)院 分析測(cè)試中心，浙江 紹興 312000)

維生素B6又稱吡哆素，是一種無(wú)色晶體，在酸液中穩(wěn)定，易溶于水和酒精.在人體內(nèi)，維生素B6以輔酶形式參與多種代謝，臨床上常用于減輕妊娠嘔吐[1].市售維生素B6片劑含有硬脂酸鎂、淀粉、糊精等輔料，因此，測(cè)定維生素B6含量時(shí)還需考慮輔料的干擾.

目前，常見(jiàn)維生素B6含量的測(cè)定方法為紫外分光光度法和高效液相色譜法，這兩種方法的測(cè)定結(jié)果均準(zhǔn)確、可靠，但對(duì)待測(cè)樣品純度要求高、樣品預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜且需提供對(duì)照品[2-3].定量核磁共振(Quantitative Nuclear Magnetic Resonance,QNMR)法用于定量分析的基礎(chǔ)是各化學(xué)環(huán)境中的質(zhì)子吸收峰的面積只與所包含的質(zhì)子數(shù)有關(guān)，不需引進(jìn)任何校正因子就可直接根據(jù)各共振峰的積分值推算所代表的自旋核的數(shù)量[4]，相較于前兩種常規(guī)方法具有樣品預(yù)處理步驟簡(jiǎn)單、無(wú)需待測(cè)物對(duì)照品、測(cè)定快速準(zhǔn)確、不破壞樣品等優(yōu)勢(shì)，已收載于《中華人民共和國(guó)藥典》[5].

目前有越來(lái)越多采用QNMR法測(cè)定維生素片劑研究的報(bào)道.例如，陳春麗等研究了片劑中維生素C含量的測(cè)定[6];胡敏芳等討論了單組分以及復(fù)合組分維生素B2、B1含量的測(cè)定[7-9]，其所建立的QNMR測(cè)試方法準(zhǔn)確度高、結(jié)果可靠；但是維生素B6含量測(cè)定的相關(guān)研究較少.本文在他人工作的基礎(chǔ)上，采用1H-NMR方法測(cè)定片劑中維生素B6的含量，以期建立維生素B6的QNMR分析法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

核磁共振波譜儀(瑞士Bruker，AVANCEⅢ 400 MHz)；超聲波振蕩儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，SK3210HP)；百萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Sartorius公司，CPA2P)；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，AL 204).

1.2 試樣和試劑

維生素B6片劑，由藥店購(gòu)買(mǎi)，標(biāo)示量每片含維生素B610 mg(華中藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20170114)；順丁烯二酸(阿拉丁試劑有限公司，經(jīng)重結(jié)晶處理)；重水(百靈威試劑有限公司)；維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁試劑有限公司，分析標(biāo)準(zhǔn)品).

1.3 維生素B6片劑溶液配制

取維生素B6片劑30粒，用研缽研成粉末.精確稱取22 mg維生素B6粉末，以及6 mg順丁烯二酸，依次加入同一塑料離心管中；再加入D2O 0.6 mL，超聲振動(dòng)10 min，使其充分溶解，靜置15 min；等到不溶的輔料沉淀完全后，取上清液進(jìn)行核磁共振定量測(cè)定.

1.4 核磁共振譜儀的調(diào)節(jié)

將裝有供試品溶液的核磁管放入核磁共振波譜儀中，調(diào)整儀器參數(shù).先進(jìn)行樣品和譜儀的調(diào)諧，仔細(xì)勻場(chǎng)后采樣，獲得1H-NMR譜；再進(jìn)行細(xì)致認(rèn)真的相位校正，對(duì)樣本和內(nèi)標(biāo)物的定量峰進(jìn)行積分.每次測(cè)定取數(shù)至少重復(fù)5次，結(jié)果取平均值.

2 方法與結(jié)果

2.1 核磁測(cè)試條件的選擇

定量峰的積分面積同多項(xiàng)核磁共振實(shí)驗(yàn)參數(shù)有關(guān).張友杰等[10]研究了峰面積與延遲時(shí)間、脈沖寬度、采樣次數(shù)、取數(shù)時(shí)間和發(fā)射偏置等因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同的檢測(cè)樣品，影響較大的兩個(gè)參數(shù)為采樣次數(shù)和延遲時(shí)間.測(cè)試條件具體如下：脈沖序列為zg 30，采樣溫度T為298 K，譜寬SW為20.55×10-6，90°脈沖為13.5 s.

2.1.1 定標(biāo)峰的選擇

維生素B6片劑樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR譜圖如圖1所示.由于使用D2O作為溶劑，兩個(gè) — OCH2— 峰(δ=4.84、δ=4.64)與位于δ=4.70的溶劑峰距離太近，不能選用.吡啶環(huán)上的 — CH3峰化學(xué)位移δ=2.48，雖處于高場(chǎng)中，但離內(nèi)標(biāo)峰(δ=6.26)太遠(yuǎn)也不宜選用.因此，只有選擇吡啶環(huán)上唯一的雜芳?xì)浞濡?8.00為定標(biāo)峰時(shí)，得到的分析結(jié)果尚屬滿意.

2.1.2 弛豫時(shí)間的選擇

設(shè)置核磁共振實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：采樣溫度298 K,采樣次數(shù)8次，測(cè)定不同弛豫時(shí)間下樣品與內(nèi)標(biāo)物的積分面積，結(jié)果見(jiàn)表1.

由表1可見(jiàn)，隨著弛豫時(shí)間的增加，當(dāng)定標(biāo)峰δ=8.00的積分面積恒定取為1時(shí)，其他幾個(gè)峰的峰面積逐漸減少；當(dāng)弛豫時(shí)間≥20 s時(shí)，質(zhì)子數(shù)與積分值趨于一致，且內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)峰面積值趨于穩(wěn)定.為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間及提高分析的效率，本實(shí)驗(yàn)選取弛豫時(shí)間為20 s.

(a)樣品 (b)標(biāo)準(zhǔn)品 圖1 維生素B6樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR譜

2.1.3 采樣次數(shù)的選擇

設(shè)置核磁共振實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：采樣溫度298 K，弛豫時(shí)間20 s，測(cè)定不同采樣次數(shù)下樣品與內(nèi)標(biāo)物的積分面積.將定標(biāo)峰δ=8.00的相對(duì)積分面積設(shè)為1，結(jié)果見(jiàn)表2.

由表2數(shù)據(jù)可見(jiàn)，當(dāng)采樣次數(shù)較少時(shí)，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性比較差；當(dāng)采樣次數(shù)≥16后，內(nèi)標(biāo)峰面積變化趨于穩(wěn)定，峰面積也趨近于實(shí)際質(zhì)子數(shù).因此，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，提高檢測(cè)的效率，本實(shí)驗(yàn)選取采樣次數(shù)為16次.

2.2 維生素B6含量的測(cè)定

由1H-NMR譜圖讀取樣品定量峰和內(nèi)標(biāo)定量峰積分面積，并使用下面的公式計(jì)算樣品的含量：

式中，WS表示內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，WX表示樣品的質(zhì)量；ES表示內(nèi)標(biāo)物的當(dāng)量，順丁烯二酸的當(dāng)量為58.04；EX表示樣品的當(dāng)量，樣品的當(dāng)量=相對(duì)分子質(zhì)量/定量峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)子數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中的該值為205.64；AS表示內(nèi)標(biāo)物定量峰峰面積，AX表示樣品的定量峰峰面積.

由表3可見(jiàn),8份樣品中維生素B6的平均含量為15.29%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.024.稱取30片維生素B6的質(zhì)量為1 830.00 mg，可知平均每片為61.00 mg，根據(jù)平均百分含量得到平均每片含量為9.327 mg，測(cè)定值在藥典規(guī)定的標(biāo)示范圍(90.0%～110.0%)內(nèi).

2.3 回收率測(cè)試

在編號(hào)為1、2、3、4、5號(hào)的核磁樣品管中分別加入維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品約3.2 mg，超聲振蕩10 min，使其充分溶解后測(cè)定核磁共振氫譜，計(jì)算樣品回收率，結(jié)果見(jiàn)表4.

表1 弛豫時(shí)間對(duì)維生素B6各峰相對(duì)面積的影響

弛豫時(shí)間/s各峰相對(duì)積分面積δ 8.00δ 6.26δ 4.84δ 2.4811.0006.7592.2573.21421.0006.6802.2333.16051.0006.6662.1753.098101.0006.6262.1523.062201.0006.6142.0873.041501.0006.6192.1013.033

表2 采樣次數(shù)對(duì)維生素B6各峰相對(duì)面積的影響

采樣次數(shù)各峰相對(duì)積分面積δ 8.00δ 6.26δ 4.84δ 2.4811.0006.6412.1073.03521.0006.6002.1423.04441.0006.6172.0953.05581.0006.6142.0873.041161.0006.5952.0953.037321.0006.5982.1053.025

表3 維生素B6含量的測(cè)定

樣品編號(hào)樣品量/mg內(nèi)標(biāo)量/mg樣品峰面積Ax內(nèi)標(biāo)峰面積As含量/%平均值/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差122.6206.5001.0006.53115.59222.3456.4341.0006.78215.04322.4106.3421.0006.63315.12422.2736.3461.0006.85214.73521.6376.7251.0006.91715.92622.7936.9771.0007.08315.31724.5467.0271.0006.56015.46822.3606.2871.0006.59515.1115.290.024

表4 維生素B6的回收率測(cè)試

樣品編號(hào)加入B6標(biāo)準(zhǔn)品量/mg樣品峰面積Ax內(nèi)標(biāo)峰面積As回收率/%平均值/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差13.2811.0003.39699.2223.2261.0003.382104.7533.2951.0003.43395.8443.3421.0003.46296.1552.9591.0003.704100.9999.390.037

由表4可知， 5個(gè)樣品的平均回收率接近100%，且重現(xiàn)性很好，這表明該方法結(jié)果可靠.

3 結(jié)論

以順丁烯二酸為內(nèi)標(biāo)、D2O為溶劑，建立了片劑中維生素B6的1H-QNMR定量方法.該方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)得片劑中維生素B6的平均含量與樣品的標(biāo)示量基本吻合，且測(cè)定值在藥典規(guī)定的標(biāo)示范圍內(nèi).多次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，可見(jiàn)測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定性也比較好.通過(guò)對(duì)維生素B6樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，表明測(cè)試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高，具有較高的可靠性.