鐵 程，張榆霞，金 玉，趙琦琳，施 擇，李愛軍，李 穎

云南省環(huán)境監(jiān)測中心站,云南 昆明 650034

浮游植物一般指浮游藻類，是懸浮于水中生活的微小藻類植物[1]。浮游植物的種類組成特點(diǎn)和數(shù)量的變化，能敏感地反映復(fù)雜的環(huán)境因子變動[2-3]。武漢東湖30年來浮游植物的演變規(guī)律以及國內(nèi)許多同類調(diào)查研究都證明：湖泊(水庫)浮游植物數(shù)量的增加，特別是藍(lán)藻豐長和生長季節(jié)的延長是湖泊富營養(yǎng)化的一個重要標(biāo)志[4]。因此，浮游植物群落結(jié)構(gòu)特征和時空變化是水環(huán)境監(jiān)測、水質(zhì)評價、水環(huán)境污染研究、水體生態(tài)修復(fù)和治理的重要內(nèi)容[4-8]。

顯微鏡計(jì)數(shù)法是淡水浮游植物測定最常用的經(jīng)典方法，不僅可以測定浮游植物生物量，還可以進(jìn)行浮游植物的種類及群落結(jié)構(gòu)分析[9]。國內(nèi)開展顯微鏡計(jì)數(shù)法測定浮游植物密度的主要依據(jù)有《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]以及《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]等規(guī)范和文獻(xiàn)。美國、英國和歐盟等國家和地區(qū)也制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。如英國的WaterQuality-GuidanceStandardontheEnumerationofPhytoplanktonUsingInvertedMicroscopy(BS/EN 15204∶2006)[12]對浮游藻類樣品的保存、準(zhǔn)備、計(jì)數(shù)、質(zhì)量保證、不確定度的評估等方面進(jìn)行了全面細(xì)致的規(guī)定。美國的StandardClassificationforSamplingPhytoplanktoninSurfaceWaters(D4149-1982)[13]規(guī)定了采集浮游藻類的常用技術(shù)和工具；StandardTestMethodforAnalysisofPhytoplanktoninSurfaceWaterbytheSedgwick-RafterMethod(D4148-1982)[14]對樣品的保存、前處理、藻細(xì)胞密度的測定過程、精密度和偏差的計(jì)算方法進(jìn)行了規(guī)定。StandardPracticeforPreservingPhytoplanktonSamples(D4137-1982)[15]對浮游植物樣品保存試劑、條件和期限進(jìn)行了規(guī)定。英國的WaterQuality-EnumerationofMicro-OrganismsinWaterSamples-GuidanceofVariationofResultwithParticularReferencetotheContributionofUncertaintyofMeasurement(BS 8496∶2007)[16]給出了在水生微生物定量分析中，測量不確定度對測定結(jié)果誤差貢獻(xiàn)的評估方法，并分析了實(shí)際案例。

國外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中有一些方法和技術(shù)值得中國研究者學(xué)習(xí)借鑒，經(jīng)驗(yàn)證、轉(zhuǎn)化后能夠用于完善中國相關(guān)規(guī)范，更好地指導(dǎo)中國淡水浮游植物的測定。

1 國外相關(guān)分析標(biāo)準(zhǔn)

美國、英國和歐盟等國家和地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)構(gòu)上有較大的區(qū)別。美國材料與試驗(yàn)協(xié)會(ASTM)按采集、保存、分析將測定過程分為3個主要部分，用8個標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行了規(guī)定。英國的BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]涵蓋了測定的全過程，并用BS 8496∶2007標(biāo)準(zhǔn)[16]規(guī)定了測量不確定度對測定結(jié)果誤差貢獻(xiàn)的評估方法。為便于介紹，按測定過程的主要環(huán)節(jié)(采樣工具、樣品保存、樣品前處理、樣品濃縮、計(jì)數(shù)對象、浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布、計(jì)數(shù)方式、適宜測定的密度、計(jì)數(shù)量與精密度、檢出限)對美國、英國和歐盟等國家和地區(qū)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行介紹。

表1 國外浮游植物測定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 List of foreign methods about the enumeration of phytoplankton

1.1 采樣工具

美國的D4149-1982標(biāo)準(zhǔn)[13]規(guī)定了采集浮游藻類的常用技術(shù)。定性樣品的采集常用浮游生物網(wǎng)和泵。定量樣品的采集常用Clarke-Bumpus浮游植物采樣器、Juday浮游植物阱和采水瓶。使用者結(jié)合研究需要、采樣區(qū)情況和浮游藻類的天然特性選擇適合的工具和技術(shù)。針對每種采樣工具，分別制定了5個規(guī)程[17-21]。

泵、Clarke-Bumpus浮游植物采樣器和Juday浮游植物阱在國內(nèi)較不常用，是一種用泵吸取所需深度的水樣，用網(wǎng)來富集浮游藻類的半定量采樣裝置，通過流量計(jì)測定進(jìn)入采樣器水樣的體積實(shí)現(xiàn)半定量。采水瓶與國內(nèi)常用的有機(jī)玻璃采水器類似。

1.2 樣品的保存

英國的BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]規(guī)定定性樣品不加保護(hù)劑，4～10 ℃暗處保存，36 h內(nèi)完成分析；定量樣本加入魯哥氏液，使其在樣品中的濃度達(dá)到5%，常溫暗處保存3個星期，1～5 ℃保存1年。若保存時間要超過1年，則需要加入37%的福爾馬林溶液，使其在樣品中的濃度達(dá)到4%。美國的D4137-1982標(biāo)準(zhǔn)[15]規(guī)定了相同的保護(hù)劑，但對定性樣品的保存環(huán)境和保存時間要求更嚴(yán)格。

1.3 樣品的前處理

BS/EN 15204∶2006[12]非常重視樣品的混勻，將混勻視為對檢測結(jié)果有重大影響的步驟。該標(biāo)準(zhǔn)指出：為了統(tǒng)一不同測定人員的混勻操作，應(yīng)該對混勻的方式、時間和力度等進(jìn)行詳細(xì)描述和規(guī)定。多次水平搖動并結(jié)合上下顛倒樣品瓶的方式對樣品的混勻效果好于單一方向的搖動。搖動的力量不易過大，否則可能導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生和群體的解離。該標(biāo)準(zhǔn)還提及：為了便于細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以用超聲波震蕩儀對群體形式的浮游植物進(jìn)行處理，以促進(jìn)群體細(xì)胞的解離，但同時要注意避免過度處理造成浮游植物細(xì)胞破損。

1.4 樣品的濃縮

D4148-1982標(biāo)準(zhǔn)[14]指出：依據(jù)鏡檢結(jié)果和分析人員的經(jīng)驗(yàn)決定是否需要對樣品進(jìn)行濃縮或稀釋處理。濃縮方式為量筒沉淀法。根據(jù)量筒中水樣的高度，按照4 h/cm計(jì)算沉淀時間。該標(biāo)準(zhǔn)還提及了一種稱重方法：稱取1 g左右的水樣于容器中，并記錄準(zhǔn)確的稱重結(jié)果，待水樣中的浮游藻類充分沉淀后，移去大部分上層水樣，再進(jìn)行稱重。用2次稱重結(jié)果計(jì)算濃縮倍數(shù)。

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]指出：濃縮水樣中的浮游藻類比較耗時，且會引入誤差，因此，應(yīng)當(dāng)盡量避免濃縮處理?？梢圆捎贸恋?、離心或過濾的方式進(jìn)行濃縮。沉淀是最常用的濃縮方式。加入到沉淀器中水樣的高度不能超過沉淀器直徑的5倍。

1.5 計(jì)數(shù)對象

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標(biāo)準(zhǔn)[22]未明確規(guī)定計(jì)數(shù)對象為細(xì)胞還是群體，而是指出以細(xì)胞為對象，計(jì)數(shù)結(jié)果較為準(zhǔn)確，但比較費(fèi)時；以群體為計(jì)數(shù)對象則較為方便，但計(jì)數(shù)結(jié)果較不準(zhǔn)確。使用者可根據(jù)自己的需求和實(shí)際情況進(jìn)行選擇，并在結(jié)果報(bào)告中說明。

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]將情況分為3種：①當(dāng)群體中的浮游植物細(xì)胞個體較易被辨識時，可將細(xì)胞作為計(jì)數(shù)對象；②當(dāng)同種浮游植物群體中所含細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定時，可將群體作為計(jì)數(shù)對象，用群體數(shù)乘以群體中平均細(xì)胞數(shù)；③當(dāng)不具備上述2個條件時，采用超聲波震蕩或水解方式離散群體中的細(xì)胞，然后以細(xì)胞為對象計(jì)數(shù)。

1.6 浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]認(rèn)為浮游植物隨機(jī)分布于計(jì)數(shù)框中是按標(biāo)準(zhǔn)開展測定、估計(jì)測定誤差的前提，并提出了一些保障措施：在計(jì)數(shù)之前，應(yīng)在低倍數(shù)下，對整個計(jì)數(shù)框進(jìn)行觀察，以確認(rèn)浮游藻類是否為隨機(jī)分布；低溫保存過的樣品，需要將其放置至室溫后，再加入計(jì)數(shù)框中；如果樣品的溫度低于計(jì)數(shù)框，通常較大、較重的浮游植物會傾向分布于計(jì)數(shù)框的周邊，較小的浮游植物傾向分布于計(jì)數(shù)框的中央。

1.7 計(jì)數(shù)方式

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]中提出了3種計(jì)數(shù)方式：隨機(jī)視野法、行條法和全片法，并指出隨機(jī)視野法能夠在工作量相對不大的情況下，給出相對最準(zhǔn)確的結(jié)果。因?yàn)樾袟l法只觀察了計(jì)數(shù)框的中間部分，如果浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布不均勻會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，而隨機(jī)視野法能夠克服這個問題。

D4148-1982標(biāo)準(zhǔn)[14]中提出了2種計(jì)數(shù)方式和適用范圍：行條法適用于藻細(xì)胞密度較低的水樣、視野法適用于藻細(xì)胞密度較高的水樣。

1.8 最佳檢測范圍

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]對適宜測定的浮游植物密度提出了定性要求：測試的水樣應(yīng)滿足藻細(xì)胞之間、藻細(xì)胞與顆粒雜質(zhì)之間不相互粘合或堆疊；過低的藻密度將導(dǎo)致大的隨機(jī)誤差；過高的藻密度將會導(dǎo)致觀察困難、耗時和測定人員的疲勞。

1.9 計(jì)數(shù)量與精密度

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]提出：浮游藻類的計(jì)數(shù)量由測定所需的精度決定。在日常分析工作中，應(yīng)事先設(shè)定精度，精度可以由標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、95%相對置信區(qū)間等表示，并且給出了相對標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)數(shù)量的關(guān)系式：

(1)

如將精密度(以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)設(shè)定為5%，則應(yīng)該至少計(jì)數(shù)400個浮游藻類。

如果精密度由置信區(qū)間表示，則用公式(2)計(jì)算：

(2)

如當(dāng)浮游藻類計(jì)數(shù)量為400個時，95%置信區(qū)間為測定結(jié)果±10%。

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標(biāo)準(zhǔn)[22]中給出了與公式(2)類似的計(jì)算方法。2個國外標(biāo)準(zhǔn)均指出：浮游植物隨機(jī)分布于計(jì)數(shù)框中，是準(zhǔn)確估計(jì)最少計(jì)數(shù)量或精密度的前提和保障。

1.10檢出限

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]認(rèn)為檢出限是浮游植物測定方法的重要性能指標(biāo)。對于隨機(jī)分布于計(jì)數(shù)框中的單種藻類，檢出限可由泊松統(tǒng)計(jì)模型得到。

(3)

式中:α為顯著水平；ndet為檢出限；ftotal為計(jì)數(shù)框的總視野數(shù)；fcounted為被計(jì)數(shù)的視野數(shù)。

2 國內(nèi)相關(guān)規(guī)范

《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]、《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]等是國內(nèi)顯微鏡計(jì)數(shù)法測定浮游植物密度的重要標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范性文獻(xiàn)。在樣品的采集、保存和濃縮方面，它們均采用了25號浮游生物網(wǎng)采集定性樣品；用有機(jī)玻璃采水器采集定量樣品；用魯哥試劑或福爾馬林試劑保存定量樣品；用沉淀法和虹吸法濃縮水樣中的浮游植物。樣品的測定方面，它們均采用了中國通用的面積為20 mm×20 mm、容量為0.1 mL的浮游植物計(jì)數(shù)框，框內(nèi)劃分橫豎各10行、10列，共100個小方格。計(jì)數(shù)方式主要有全片法、行格法、視野法和對角線法。觀察和計(jì)數(shù)全部100個小格的全片法較耗時耗力，一般較多采用觀察計(jì)數(shù)框中的一部分區(qū)域的方法(如觀察藻類計(jì)數(shù)框中第2、5、8行，共30個小方格的行格法，觀察一定數(shù)量的顯微鏡可見區(qū)域的視野法，只觀察位于計(jì)數(shù)框?qū)蔷€位置上的10個小方格的對角線法等)。質(zhì)量控制方面，它們均規(guī)定“不大于±15%”，但對誤差的描述有所不同，分別為“兩片計(jì)數(shù)結(jié)果個數(shù)相差”“每次計(jì)數(shù)的結(jié)果與其平均值之差”和“相對偏差”。

3 國內(nèi)規(guī)范中的不足

3.1 國內(nèi)規(guī)范未對浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布提出要求

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]很重視浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布，認(rèn)為浮游植物隨機(jī)分布是準(zhǔn)確測定和估計(jì)測量不確定度的前提。

對于僅觀察計(jì)數(shù)框中部分區(qū)域的計(jì)數(shù)方式，浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布對測定的精密度有較大影響。筆者分析了3家實(shí)驗(yàn)室用對角線法重復(fù)測定洱海、撫仙湖和滇池水樣的結(jié)果(表2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，浮游植物在計(jì)數(shù)框中越符合泊松分布，重復(fù)測定結(jié)果的一致性越好。

《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]和《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]等標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范性文獻(xiàn)沒有對浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布提出要求，也沒有給出促使浮游植物隨機(jī)分布于計(jì)數(shù)框中的有關(guān)措施。

3.2 國內(nèi)規(guī)范未對設(shè)定最少計(jì)數(shù)量進(jìn)行說明

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]提出由測定所需的精密度決定浮游植物的計(jì)數(shù)量，并給出了兩者的定量關(guān)系式。在開始測定前應(yīng)先設(shè)定測定需達(dá)到的精度要求，然后根據(jù)定量關(guān)系式算出測定中所需的最少計(jì)數(shù)量。StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標(biāo)準(zhǔn)[22]中提出可根據(jù)浮游植物的計(jì)數(shù)量估計(jì)測定結(jié)果的置信區(qū)間，相反也能夠根據(jù)測定誤差的要求，計(jì)算所需的最少計(jì)數(shù)量。

筆者分別應(yīng)用對角線法、行格法和全片法對稀釋10倍、原水和濃縮10倍的洱海水樣進(jìn)行了重復(fù)(7次)測定。通過統(tǒng)計(jì)平均計(jì)數(shù)量、平均觀察到的浮游植物種類數(shù)和重復(fù)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(表3)發(fā)現(xiàn)：①隨計(jì)數(shù)量的增加，觀察到的浮游植物種類越多(圖1);②隨計(jì)數(shù)量的增加，重復(fù)測定結(jié)果越一致(圖2);③根據(jù)擬合方程的測算，當(dāng)浮游植物最少計(jì)數(shù)量不少于1 200個時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差能達(dá)到小于15%的要求。牛海玉等采集了3座不同營養(yǎng)水平的水庫及3組不同處理的實(shí)驗(yàn)圍隔樣品，對每個樣品進(jìn)行了重復(fù)測定，同樣發(fā)現(xiàn)隨計(jì)數(shù)量的增加，浮游植物豐度偏差減小，并且隨計(jì)數(shù)量增加鏡檢到的浮游植物種類數(shù)增加[23]。

表2 3家實(shí)驗(yàn)室重復(fù)測定結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 2 Repeated measurement results and statistical analysis results in three laboratories

表3 重復(fù)測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistical results of repeated determination

圖1 浮游植物細(xì)胞計(jì)數(shù)量與觀察到的浮游植物種類的關(guān)系Fig.1 Relationship between phytoplankton counts and observed phytoplankton species

圖2 浮游植物細(xì)胞計(jì)數(shù)量與重復(fù)測定結(jié)果一致性的關(guān)系Fig.2 Relationship between phytoplankton counts and the consistency of repeated measurements

《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]和《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]中未明確最少計(jì)數(shù)量的要求。《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)規(guī)定了計(jì)數(shù)量宜為500～1 500個，但表述過于簡單，未明確將計(jì)數(shù)量與精密度聯(lián)系起來，不便于測定人員根據(jù)測定要求設(shè)定合理的計(jì)數(shù)量。

3.3 國內(nèi)規(guī)范未給出檢出限的確定方法

《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》(SL 733—2016)、《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范(第二版)》[11]和《湖泊生態(tài)調(diào)查觀測與分析》[1]中沒有給出顯微鏡計(jì)數(shù)法的檢出限，也沒有給出確定檢出限的方法。雖然《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)中給出了確定檢出限的方法，但顯微鏡計(jì)數(shù)法與化學(xué)分析方法有較大區(qū)別，難以直接應(yīng)用該導(dǎo)則中的方法確定其檢出限。

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]提出了關(guān)于浮游植物的測定——顯微鏡計(jì)數(shù)法的檢出限定義:對于單種藻類，在單次計(jì)數(shù)過程中，發(fā)現(xiàn)它的概率不低于某個規(guī)定要求時，該藻類在水樣中的密度即為檢出限，并應(yīng)用泊松分布模型計(jì)算滿足檢出限定義的藻密度。

借鑒BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]的定義和計(jì)算方法，將顯微鏡計(jì)數(shù)法的檢出限定義為對于單種藻類，在單次計(jì)數(shù)過程中，發(fā)現(xiàn)它的概率不低于99%時，最低的藻密度即為檢出限。以泊松分布模型為基礎(chǔ)，對國內(nèi)規(guī)范中的對角線計(jì)數(shù)、行格計(jì)數(shù)、全片計(jì)數(shù)和隨機(jī)視野計(jì)數(shù)的檢出限進(jìn)行計(jì)算。泊松分布模型計(jì)算公式為

(4)

式中：P(x)為連續(xù)觀察n個計(jì)數(shù)格，每個計(jì)數(shù)格出現(xiàn)x個藻細(xì)胞的概率；λ為單個計(jì)數(shù)格中浮游植物細(xì)胞平均數(shù)量，個；x為預(yù)計(jì)單個計(jì)數(shù)格中浮游植物細(xì)胞的數(shù)量，個；n為觀察的計(jì)數(shù)格數(shù)，個。

為結(jié)合實(shí)際測定過程，將上述檢出限的定義適當(dāng)轉(zhuǎn)化為對于單種浮游植物，連續(xù)觀察計(jì)數(shù)框中的n個計(jì)數(shù)格后，未發(fā)現(xiàn)它的概率為1%時，所對應(yīng)的水樣中該種類浮游植物的細(xì)胞密度。根據(jù)定義可知：P(x)=1%、x=0，求λ。帶入式(4)得到式(5)：

(5)

式中：λ為單個計(jì)數(shù)格中浮游植物細(xì)胞平均數(shù)量，個；n為觀察的計(jì)數(shù)格數(shù)，個。

再將λ的計(jì)算結(jié)果帶入式(6)，即可得出檢出限。

DL=Nλ/v

(6)

式中：DL為檢出限，個/L；N為計(jì)數(shù)框中計(jì)數(shù)格的總數(shù)，個；v為加入計(jì)數(shù)框中的水樣的體積，L。

對角線計(jì)數(shù)、行格計(jì)數(shù)檢出限的計(jì)算：已知N=100個，v=0.000 1 L，對角線計(jì)數(shù)、行格計(jì)數(shù)觀察的計(jì)數(shù)格分別為n=10、n=30個，將已知參數(shù)代入式(4)、式(5)可算得對角線計(jì)數(shù)、行格計(jì)數(shù)的檢出限分別為DL=4.6×105個/L，DL=1.5×105個/L。

全片計(jì)數(shù)檢出限的計(jì)算：當(dāng)對整個計(jì)數(shù)框中全部100個計(jì)數(shù)格逐一觀察計(jì)數(shù)時，如果觀察過程十分細(xì)致，計(jì)數(shù)框中僅有1個浮游植物細(xì)胞也能夠被檢出。因此，全片計(jì)數(shù)法決定檢出限的環(huán)節(jié)是從樣品中吸取0.1 mL水樣裝入計(jì)數(shù)框時，吸取到0個藻細(xì)胞的概率為1%時，樣品中藻細(xì)胞的密度。因此需將式(4)、式(5)中各參數(shù)的意義調(diào)整為P(x)為0.1 mL水樣中含有x個藻細(xì)胞時的概率；λ為0.1 mL中含有藻細(xì)胞的平均數(shù)量，個；x為預(yù)計(jì)0.1 mL水樣中含有藻細(xì)胞的數(shù)量，個；n為從水樣中取樣的次數(shù)。

將式(6)改為式(7)：

DL=λ/v

(7)

式中：DL為檢出限，個/L；v為吸取水樣的體積，L。

已知：P(x)=1%，x=0個，n=1次，v=0.000 1 L，代入式(5)、式(6)后求得λ=4.6個、全片計(jì)數(shù)法的DL=4.6×104個/L。

隨機(jī)視野檢出限的計(jì)算：由于檢出限與觀察的視野數(shù)、視野面積和計(jì)數(shù)框面積有關(guān)，根據(jù)式(8)、式(9)計(jì)算：

(8)

(9)

式中：λ為單個視野中浮游植物細(xì)胞平均數(shù)量，個;n為隨機(jī)視野數(shù)，個；DL為檢出限，個/L；S為計(jì)數(shù)框的面積，cm2；s為一個視野的面積，μm2；v表示加入計(jì)數(shù)框中的水樣的體積，L。

如已知計(jì)數(shù)框的面積為S=4 cm2。顯微鏡放大倍數(shù)為400倍時，經(jīng)校準(zhǔn)得知1個視野的面積為s=90 716.8 μm2。在觀察了n=300個視野的條件下，經(jīng)計(jì)算隨機(jī)視野的DL=6.8×105個/L。

表4 4種計(jì)數(shù)方式的檢出限Table 4 Detection limits of 4 kinds of counting pattern

注：隨機(jī)視野方式的檢出限與觀察的視野數(shù)、視野面積和計(jì)數(shù)框面積有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體測定條件進(jìn)行計(jì)算。

4 完善國內(nèi)規(guī)范的建議

4.1 對浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布提出要求

浮游植物隨機(jī)分布于計(jì)數(shù)框中是提高測定精密度，準(zhǔn)確估計(jì)測定誤差和確定檢出限的保障。因此，在相關(guān)規(guī)范中應(yīng)提出“在開始顯微鏡計(jì)數(shù)前，應(yīng)先確認(rèn)浮游植物隨機(jī)分布于計(jì)數(shù)框中”的要求，并提出一些保障措施(如應(yīng)在開始計(jì)數(shù)前在顯微鏡的低放大倍數(shù)下，對浮游植物在計(jì)數(shù)框中的分布進(jìn)行確認(rèn)，當(dāng)滿足隨機(jī)分布時才開始計(jì)數(shù)；經(jīng)低溫保存的樣品，在向計(jì)數(shù)框中加注水樣前，應(yīng)將樣品在室溫下放置足夠長的時間，使水樣與計(jì)數(shù)框的溫度相同)。

4.2 對浮游植物的最少計(jì)數(shù)量提出要求

一般來說，測定中對浮游植物的計(jì)數(shù)量越多，重復(fù)測定結(jié)果間的一致性越好，同時觀察到的浮游植物種類數(shù)也越多。但一味增加計(jì)數(shù)量會造成測定時間的延長，會導(dǎo)致計(jì)數(shù)框中樣品的過量蒸發(fā)和空氣的進(jìn)入，反而嚴(yán)重影響測定的準(zhǔn)確性。因此在相關(guān)規(guī)范中應(yīng)結(jié)合測定精度的要求，提出恰當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)量，使測定方案一方面滿足精度要求，盡量減少遺漏的浮游植物種類，另一方面使工作量在可接受范圍內(nèi)。

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]中提出的：由測定所需的精度決定浮游植物的計(jì)數(shù)量(并給出了兩者的定量關(guān)系式)，為如何確定最少計(jì)數(shù)量提供了參考依據(jù)，值得國內(nèi)相關(guān)研究人員參考和借鑒。

4.3 給出檢出限的確定方法

檢出限是分析方法重要的性能指標(biāo)之一，在《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)中規(guī)定，檢出限是環(huán)境監(jiān)測分析方法的必備要素，在相關(guān)規(guī)范中應(yīng)給出顯微鏡計(jì)數(shù)法的檢出限或檢出限的確定方法，但該導(dǎo)則中給出的確定檢出限的方法不適用于顯微鏡計(jì)數(shù)法。

BS/EN 15204∶2006標(biāo)準(zhǔn)[12]將顯微鏡計(jì)數(shù)法的檢出限定義為在測定過程中發(fā)現(xiàn)某種浮游植物的概率不低于某個要求時，該種浮游植物在水樣中的密度，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出符合定義要求的浮游植物的密度。這種確定顯微鏡計(jì)數(shù)法檢出限的方法值得國內(nèi)相關(guān)研究人員參考和借鑒。