吳 濤，郭冰潔，董亞非,

(1.陜西師范大學(xué) 計(jì)算機(jī)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

0 引 言

電子計(jì)算機(jī)作為20世紀(jì)最重要的科技發(fā)明之一，經(jīng)過幾十年的迅猛發(fā)展，逐漸成為人類社會(huì)不可或缺的一部分。然而，隨著人們對(duì)于計(jì)算機(jī)的速度以及信息存儲(chǔ)能力的要求越來越高，電子元器件的發(fā)展逐漸接近其物理極限。研究者們亟待找到新型材料來替代傳統(tǒng)的硅基材料。

經(jīng)過進(jìn)一步研究，DNA的高度并行性、易操作、高存儲(chǔ)的特性進(jìn)入了大家的視野。因?yàn)镈NA具有精確的分子識(shí)別能力和極強(qiáng)的信息存儲(chǔ)能力，所以以核酸分子生物學(xué)特性為基礎(chǔ)來構(gòu)建分子級(jí)別的布爾邏輯門[1]并實(shí)現(xiàn)相關(guān)邏輯運(yùn)算，成為近年來分子計(jì)算機(jī)科學(xué)和分子生物學(xué)交叉產(chǎn)生的新興科研領(lǐng)域，并在生物醫(yī)學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)領(lǐng)域起到了一定的指導(dǎo)意義，引起了研究者的廣泛關(guān)注[2]。

與傳統(tǒng)的計(jì)算機(jī)材料相比，生物分子整體具有很強(qiáng)大的并行反應(yīng)計(jì)算性；生物分子之間的相互雜交使得它運(yùn)算時(shí)能夠保持很高的穩(wěn)定性；更為重要的是，作為組成DNA分子的含氮堿基：腺嘌呤(adenine，A)，胸腺嘧啶(thymine，T)，胞嘧啶(cytosine，C)和鳥嘌呤(guanine，G)之間具有嚴(yán)格的配對(duì)形式—A-T，G-C。因此核酸材料憑借這些優(yōu)勢(shì)使得研究新型邏輯結(jié)構(gòu)、電路甚至計(jì)算機(jī)體系成為可能。

1961年，Richard Feynman[3]從理論上描述了在分子水平上構(gòu)造亞微觀計(jì)算機(jī)的可能性。1994年，美國科學(xué)家Adleman[4]通過DNA序列的方法來解決著名的NP完全問題——Hamilton Graph，由此開創(chuàng)了DNA計(jì)算[5]的先河。

以DNA和相關(guān)生物酶為基本材料的DNA計(jì)算是利用某些生化反應(yīng)模擬某些問題的求解運(yùn)算過程的新型分子生物計(jì)算方法。其核心就是將編碼的DNA鏈作為輸入信息，在特殊的生物平臺(tái)上經(jīng)過一定時(shí)間的可控生化反應(yīng)后，通過分析反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)而得出問題的最優(yōu)解[6]。因此DNA計(jì)算有望解決目前電子計(jì)算機(jī)無法解決的問題，諸如一些NP-完全問題、破譯密碼問題等等。

目前，國內(nèi)外在DNA計(jì)算領(lǐng)域內(nèi)的研究成果頗多，大大促進(jìn)了數(shù)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物科學(xué)的相互融合。DNA自組裝[7]作為DNA計(jì)算的理論基礎(chǔ)之一，因此研究人員基于其特性來解決最大團(tuán)問題[8]、N皇后問題[9]、多維背包問題[10]、二部圖完美匹配問題[11]、最大匹配問題[12]等等。另外，研究者們還利用DNA計(jì)算進(jìn)行圖像加密[13]，Xp模型檢測(cè)[14]、可滿足性問題[15]以及邏輯門的構(gòu)建[16-18]。隨之產(chǎn)生了一系列相關(guān)技術(shù)被運(yùn)用到這個(gè)新的領(lǐng)域中，例如DNA雜交、DNA鏈置換技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)等等。其中DNA鏈置換技術(shù)[19-20]最為矚目，原因在于它的自發(fā)性，特異性識(shí)別，高度的靈敏性以及準(zhǔn)確性使之成為DNA計(jì)算的基礎(chǔ)之一。而作為檢測(cè)分子計(jì)算是否進(jìn)行的熒光標(biāo)記技術(shù)也得到了長足的發(fā)展。

文中擬通過熒光標(biāo)記技術(shù)以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)[21]構(gòu)建與非邏輯門，在該邏輯系統(tǒng)中，將365 nm波長光照以及Hg2+作為輸入信號(hào)，可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的線性單鏈DNA分子作為輸出信號(hào)，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)輸入信號(hào)的精確檢測(cè)。接下來，利用形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步構(gòu)建邏輯半加器。在此邏輯系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)的線性單鏈DNA分子作為輸入信號(hào)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)域具有DNA識(shí)別區(qū)域，使得特設(shè)的線性單鏈DNA可以將莖環(huán)通過鏈置換反應(yīng)而打開，再結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)輸出的精確檢測(cè)。

1 DNA鏈置換技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)

1.1 DNA鏈置換技術(shù)

DNA鏈置換技術(shù)是DNA分子計(jì)算的基礎(chǔ)之一，憑借著自身的能級(jí)引發(fā)性、特性識(shí)別性、準(zhǔn)確與靈敏來實(shí)現(xiàn)DNA鏈的釋放與結(jié)合。目前此技術(shù)已經(jīng)在生物計(jì)算領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。

DNA鏈置換反應(yīng)開始于立足點(diǎn)區(qū)域的識(shí)別與雜交，通過分支遷移的過程將目標(biāo)鏈輸出，最終形成更為穩(wěn)定的多鏈結(jié)構(gòu)[22-23]。DNA鏈置換一般有可逆的鏈置換反應(yīng)與不可逆的鏈置換反應(yīng)兩種表現(xiàn)形式[24]。不同形式的DNA鏈置換原理如圖1所示[25]。

圖1 DNA鏈置換原理

1.2 熒光標(biāo)記技術(shù)

熒光標(biāo)記技術(shù)指利用一些能發(fā)射熒光的物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來提供被研究對(duì)象的信息。生物分子計(jì)算領(lǐng)域通過檢測(cè)標(biāo)記在基團(tuán)上熒光分子的熒光強(qiáng)度相對(duì)變化量來做出某種判斷。熒光猝滅是熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)之間產(chǎn)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移[26]作用，主要表現(xiàn)是：

(1)當(dāng)熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互接近時(shí)，兩基團(tuán)之間的相互作用增強(qiáng)，熒光信號(hào)削弱乃至消失；

(2)當(dāng)熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互遠(yuǎn)離時(shí)，兩基團(tuán)之間的相互作用減弱，熒光信號(hào)得以重新恢復(fù)。

相對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記原理如圖2所示。

圖2 熒光標(biāo)記技術(shù)原理

2 DNA邏輯計(jì)算模型設(shè)計(jì)

2.1 與非門原理

與非門[27]是數(shù)字電路的一種基本邏輯電路。它可以看作是由“與”門和“非”門組合而成，具有兩個(gè)輸入信號(hào)和一個(gè)輸出信號(hào)?？偠灾跀?shù)字電路中若輸入均為高電平(1)，則輸出為低電平(0)；若輸入中至少有一個(gè)為低電平(0)，則輸出為高電平(1)。其操作見圖3(c)。

2.2 與非門邏輯模型設(shè)計(jì)

6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)是一種常用于標(biāo)記DNA鏈的熒光染料，苯甲酸(Carboxybenzene，Dabcyl)則是作為猝滅基團(tuán)標(biāo)記DNA鏈。胸腺嘧啶T可以被6-硝基胡椒基甲醛(6-nitro piperonyl oxymethylene，NPOM)所包裹，被包裹的T在受到波長為365 nm的光照射后便會(huì)釋放出來[28]。Hg2+能夠綁定T-T堿基對(duì)，使其錯(cuò)配形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)[29]。

如圖3(a)所示，在分子與非門的設(shè)計(jì)中，其初始狀態(tài)是由可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的線性單鏈DNA構(gòu)建。該單鏈DNA包含a、b、c、d、a15個(gè)部分。其中a區(qū)域與a1區(qū)域個(gè)別堿基互補(bǔ)，并且a區(qū)域的T堿基被NPOM包裹。在a區(qū)域也即單鏈的5’端用Dabcyl熒光猝滅基團(tuán)進(jìn)行修飾，a1區(qū)域也即單鏈的3’端用FAM熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾。起初，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互遠(yuǎn)離，故而熒光強(qiáng)度不變；當(dāng)熒光基團(tuán)與熒光猝滅基團(tuán)結(jié)合之后，體系中熒光的強(qiáng)度會(huì)相應(yīng)減弱。在該系統(tǒng)中，輸入信號(hào)是365 nm波長光照以及金屬Hg2+離子，通過對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)判斷輸出結(jié)果。反應(yīng)結(jié)束后，若能檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明輸出結(jié)果為邏輯值1，否則輸出結(jié)果為邏輯值0。

圖3 邏輯與非門操作機(jī)制

在上述分子邏輯操作中，只有當(dāng)兩個(gè)輸入信號(hào)都存在時(shí)，沒有熒光信號(hào)出現(xiàn)，與非門的操作有4種方式：

(1)當(dāng)體系中只有單鏈DNA存在時(shí)，即輸入(0，0)。也就是沒有任何信號(hào)輸入時(shí)，熒光信號(hào)存在，邏輯輸出值為1。

(2)當(dāng)只有365 nm波長的光照照射時(shí)，即輸入(0，1)。a區(qū)域中被NPOM包裹的T堿基暴露出來，但是由于a區(qū)域與a1區(qū)域并不能完全互補(bǔ)配對(duì)，所以猝滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)并未結(jié)合，熒光信號(hào)依然存在，邏輯輸出結(jié)果為1。

(3)當(dāng)只有金屬Hg2+離子加入體系當(dāng)中，即輸入(1，0)。由于a區(qū)域的T堿基被包裹，無法與a1區(qū)域的T堿基錯(cuò)配成T-Hg2+-T的結(jié)構(gòu)，所以a區(qū)域與a1區(qū)域仍舊不能實(shí)現(xiàn)完全配對(duì)，熒光信號(hào)依然存在，邏輯輸出結(jié)果為1。

(4)當(dāng)365 nm波長光照與金屬Hg2+同時(shí)存在時(shí)，即輸入(1，1)。暴露出來的T堿基錯(cuò)配成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，a區(qū)域與a1區(qū)域?qū)崿F(xiàn)完全配對(duì)，單鏈DNA形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)結(jié)合，熒光信號(hào)減弱甚至消失，邏輯結(jié)果輸出為0。

2.3 半加器原理

半加器電路是指對(duì)兩個(gè)輸入數(shù)據(jù)位相加，輸出一個(gè)結(jié)果位和進(jìn)位，沒有進(jìn)位輸入的加法器電路，是實(shí)現(xiàn)兩個(gè)一位二進(jìn)制數(shù)的加法運(yùn)算電路。它的運(yùn)算可以看作是邏輯“異或”門與邏輯“與”門組合進(jìn)行并行計(jì)算的過程。其中，“異或”門的輸出結(jié)果為和位，“與”門的輸出結(jié)果當(dāng)進(jìn)位。半加器的計(jì)算過程見圖4(C)。

2.4 半加器邏輯模型設(shè)計(jì)

G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基G的DNA或RNA序列形成的一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)[30]。G-四鏈體DNA酶則是由G-四鏈體與氯化血紅素(Hemin)結(jié)合后形成的具有辣根過氧化物酶活性的DNA酶[31]。這種DNA酶可催化雙氧水(H2O2)氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)產(chǎn)生肉眼可見的可溶性藍(lán)色產(chǎn)物[32]。

如圖4(a)所示，在半加器的設(shè)計(jì)中，其初始狀態(tài)為與非門產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的b和c區(qū)域都有識(shí)別區(qū)域，可以分別與設(shè)計(jì)的Ha-In1與Ha-In2兩條DNA單鏈的c*區(qū)域與b*區(qū)域互補(bǔ)。鏈Ha-In1與鏈Ha-In2互補(bǔ)，并且鏈Ha-In1的5’端與鏈Ha-In2的3’端富含G堿基，可以相互反應(yīng)生成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。在該系統(tǒng)中，輸入信號(hào)是單鏈DNA，通過檢測(cè)熒光信號(hào)來判斷輸出結(jié)果，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，如果能檢測(cè)到熒光信號(hào)，則判斷輸出結(jié)果為邏輯值1，否則邏輯值為0。

在上述分子邏輯操作中，如果沒有輸入信號(hào)，邏輯值為0；如果有輸入信號(hào)，邏輯值為1。半加器的操作有4種方式：

(1)當(dāng)體系中沒有任何輸入時(shí)，即輸入為(0，0)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)(M)中熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)結(jié)合，沒有熒光信號(hào)發(fā)出，邏輯輸出結(jié)果為(0，0)。

(2)當(dāng)輸入鏈Ha-In1時(shí)，即輸入為(0，1)。鏈Ha-In1與莖環(huán)結(jié)構(gòu)(M)結(jié)合形成雙鏈，通過鏈置換反應(yīng)將莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光基團(tuán)FAM產(chǎn)生熒光。邏輯輸出結(jié)果為(0，1)。

(3)當(dāng)輸入鏈Ha-In2時(shí)，即輸入為(1，0)。鏈Ha-In2與莖環(huán)結(jié)構(gòu)(M)結(jié)合形成雙鏈，通過鏈置換反應(yīng)將莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光基團(tuán)FAM產(chǎn)生熒光。邏輯輸出結(jié)果為(0，1)。

(4)當(dāng)輸入鏈Ha-In1與鏈Ha-In2時(shí)，即輸入為(1，1)。鏈Ha-In1與鏈Ha-In2之間相互反應(yīng)配對(duì)，富含G堿基的一端形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與Hemin結(jié)合從而促進(jìn)H2O2氧化TMB為藍(lán)色的TMB+。莖環(huán)結(jié)構(gòu)未被打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互作用，沒有熒光信號(hào)發(fā)出，邏輯輸出結(jié)果為(1，0)。

2.5 序列設(shè)計(jì)

文中涉及到的DNA鏈?zhǔn)抢肗UPACK仿真軟件[33]設(shè)計(jì)得出，如表1所示。在序列設(shè)計(jì)的過程中，以堿基互補(bǔ)配對(duì)為原則，并結(jié)合模型的需要，進(jìn)行些許調(diào)整。

圖4 半加器操作機(jī)制

DNA鏈序列編碼(5’-3’)a b c d a1Dabcyl-GAT*CGT* GCAC CAGCTG CACT TCGTTC-FAMHa-In1(gfa1*d*c*e)GGGT ATTAATG GAACGA CGTA CAGCTG GTAHa-In2(e*c b*a*f*h)TAC CAGCTG GTCG ACGTTC CATTAAT TGGGCGGGAAGGG

3 結(jié)束語

基于DNA鏈置換技術(shù)，以單鏈DNA作為基本計(jì)算材料，結(jié)合重金屬離子與DNA之間的特殊反應(yīng)，通過熒光標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建組成復(fù)雜邏輯電路的組成單元—邏輯門。在簡單邏輯門的基礎(chǔ)上尋求構(gòu)建更加穩(wěn)定的DNA分子計(jì)算邏輯模型，以實(shí)現(xiàn)可組裝的功能化的DNA分子邏輯組件。隨著技術(shù)的進(jìn)步，DNA計(jì)算理論還將繼續(xù)蓬勃發(fā)展，DNA計(jì)算模型也可能終將走出試管，走向標(biāo)準(zhǔn)化的DNA計(jì)算芯片。DNA計(jì)算中的“圖靈機(jī)”或許就誕生于不久的將來，生物計(jì)算時(shí)代的明天會(huì)更加美好。