蘭 月，黃利豪，劉 鵬，陳旅翼

(中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074)

1 引言

高良姜別名蜜姜、南姜、小良姜等，是姜科山姜屬植物(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖。全國野生高良姜的主產地分布在廣東、廣西、海南和云南等地。高良姜性熱味辛，主要有溫胃散寒，消食止痛的功效，是治療脘腹冷痛，胃寒嘔吐，噯氣吞酸等癥狀的良好藥材[1]。高良姜主要化學成分有黃酮類、糖苷類、苯丙素類、揮發(fā)油類、二芳基庚烷類。而黃酮類成分主要有高良姜素、山柰素、山柰酚、槲皮素、異鼠李素等[2]。本文探索了高良姜中高良姜素的提取純化條件，為高良姜的進一步藥理學研究提供材料，也為山姜屬植物的開發(fā)利用開拓思路。

2 儀器與試劑

2.1 材料

高良姜藥材購于安國市盛輝中藥飲片有限公司，產地廣東湛江，由中南民族大學陳旅翼副教授鑒定為高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的根。

2.2 標樣與試劑

高良姜素標準品(中國藥品生物制品檢定所)。乙腈、甲醇(TEDIA COMPANY，INC)為色譜純；其余試劑為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。AB-8大孔吸附樹脂：上海摩速科學器材有限公司；聚酰胺樹脂(國藥集團化學試劑有限公司)。色譜柱(250×4.6mm， Agilent 5 TC-C18)。

2.3 儀器

高效液相色譜儀(UltiMate3000，美國戴安公司)；旋轉蒸發(fā)儀(RE52CS-1，上海亞榮生化儀器廠)；水浴鍋(B-260，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(JY1002，上海浦春計量儀器有限公司)。

3 實驗方法

3.1 標準曲線的制作

根據2015年版中國藥典規(guī)定，設置色譜條件：流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長266 nm，以乙腈-0.2%磷酸溶液(55∶45)為流動相，進樣量10 μL，進樣20 min[3]。

精密稱取高良姜素對照品0.0040 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，濃度為40 μg/mL，分別依次進樣1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL。按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2。

3.2 高良姜素得率和含量的測定方法

將供試品過微孔濾膜(0.45 μm)，轉入液相小瓶備用。按“標準曲線的制作”項下進行操作，測定峰面積，根據回歸方程計算被測樣品中高良姜素含量。

得率=提取物質量/藥材質量×100%

3.3 提取條件單因素試驗

選取藥材提取的乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度等4個可能影響提取效果的因素做單因素實驗，以確定相關因素及各因素的合適范圍。

3.4 提取條件正交試驗

運用正交試驗設計來優(yōu)化提取工藝，在單因素實驗基礎上，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間等4個影響較大的因素進行優(yōu)化組合，考察指標為高良姜素得率和含量，因素水平見表1。

表1 因素水平

3.5 大孔吸附樹脂純化

大孔吸附樹脂是一類主要應用于中草藥化學成分的分離與純化的有機高聚物吸附劑[4]。大孔吸附樹脂具有穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨特、富集效果好、解吸條件溫和、不受無機物影響、再生簡便、使用周期長等優(yōu)點[5]。本試驗選用AB-8大孔樹脂聯合聚酰胺樹脂對高良姜素進行純化。

4 結果與討論

4.1 工作曲線及線性方程

用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為：Y=86.292X+0.1903，R2=1。高良姜素進樣量在0.04 μg～0.8 μg與峰面積線性關系良好。

表2 高良姜素標準曲線方程

4.2 提取條件單因素試驗

4.2.1 乙醇濃度對高良姜素得率和含量的影響

固定料液比1∶10(g/mL)，提取時間2 h，提取溫度90 ℃、提取次數1次，考察不同乙醇濃度80%、85%、90%、95%，對高良姜素含量和得率的影響，結果見圖1。隨著乙醇濃度的增加，高良姜素得率和含量隨之增大。當乙醇濃度為90%時，得率和含量皆有所下降。因為乙醇濃度較低時，提取液中蛋白質，糖類等水溶性物質大量溶出，雜質含量較高，而醇濃度過高，脂溶性的物質溶出也增多，影響高良姜素的溶出。

4.2.2 料液比對高良姜素得率和含量的影響

固定乙醇濃度90%，提取時間2 h，提取溫度90 ℃、提取次數1次，考察不同料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)，對高良姜素含量和得率的影響，結果見圖2。不同料液比對高良姜素含量的變化影響較小，增幅在14.40%左右。料液比在1∶6～1∶12時，得率隨料液比增大而增大，而料液比為1∶10時得率降低。當料液比較小時，溶劑用量的增加會使傳質力加快，有利于高良姜素的提取。從浸提效果、減少溶劑用量和降低濃縮負荷等方面考慮，料液比為1∶8比較合適[6]。

圖1 乙醇濃度對高良姜素得率和含量的影響

圖2 料液比對高良姜素含量和得率的影響

4.2.3 提取時間對高良姜素得率和含量的影響

固定乙醇濃度90%，料液比1∶8，提取溫度90 ℃、提取次數1次，考察不同提取時間1、1.5、2、2.5、3 h，對高良姜素含量和得率的影響，結果見圖3。高良姜素含量隨著時間的增大而緩慢增大，而高良姜素含量在3 h時明顯下降。高良姜素得率隨著時間的增加而降低，而在1.5 h時達到峰值，這是因為時間的增大可以使高良姜素最大限度地溶出，但是時間過長會使高良姜中其它成分溶出，降低了高良姜素的含量，而且周期延長不利于生產。

圖3 提取時間對高良姜素含量和得率的影響

4.2.4 提取溫度對高良姜素得率和含量的影響

固定乙醇濃度90%，料液比1∶8、提取時間2.5 h、提取次數1次，考察不同提取溫度60、70、80、90、100 ℃，對高良姜素含量和得率的影響，結果見圖4。隨著溫度的升高，高良姜素的得率增大，而在80℃以后，得率減小。高良姜素含量會隨著溫度的升高而降低。因為溫度的升高會使高良姜素在乙醇中中的溶解度增大，而溫度過高，使得高良姜素遭到破壞。此外，溫度過高，會使得雜質的溶出量增加，給后續(xù)的分離提純操作帶來不便。所以溫度在60～70 ℃的范圍內比較合適。

圖4 提取溫度對高良姜素含量和得率的影響

4.3 提取條件正交試驗結果

由表3可以看出，各因素對高良姜素綜合值影響的主次順序為：提取溫度>料液比>乙醇濃度>提取時間。確定最佳提取條件為A2B1C1D3，即乙醇濃度90%、料液比1∶6(g/mL)、提取時間1 h、提取溫度80 ℃。

對正交試驗進行驗證，選取最優(yōu)組合平行三次試驗，得出平均綜合值為2.00，證明采用此工藝提取高良姜酚酸合理、可行、穩(wěn)定。

綜合值=含量/最高含量(5.21%)+得率/最高得率(79.46%)。

4.4 大孔樹脂純化結果

按照上述試驗優(yōu)選出的條件進行高良姜素的提取，抽濾，旋蒸濃縮至無醇味，加入原液1/2體積的40%乙醇溶解，即得上樣液。先用AB-8型大孔樹脂柱吸附，得到高良姜素純度為21.80%。再用聚酰胺樹脂柱吸附，所得高良姜素的純度為45.77%。洗脫方法皆為：用蒸餾水、30%乙醇除雜，再用50%、70%、95%的乙醇梯度洗脫，合并組分得到高良姜素。

表3 L9(34)正交試驗結果

5 結論

通過正交試驗確定了高良姜素的最佳提取工藝為原料重6倍的90%乙醇為溶劑，在80℃下提取1h，該工藝的得率可達到81.59%，含量可達到6.38%。AB-8大孔樹脂和聚酰胺樹脂聯用進行純化后，所得高良姜素的純度為45.77%。