熊敏琪，唐曉婷，崔金剛，丁李立強(qiáng)，唐新淼，王培偉，陳 瑜＊＊，張 騰＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437；2. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所 上海 200437）

高血壓是冠心病發(fā)病和死亡的主要危險(xiǎn)因素，也是腦卒中的高危因素，占世界范圍內(nèi)主要死亡疾病譜的主導(dǎo)地位。近年來圍繞高血壓發(fā)病和防治的研究不斷呈現(xiàn)新的成果，腸道屏障及其功能等研究為諸多復(fù)雜性疾病發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)產(chǎn)生了巨大影響，也為高血壓發(fā)生機(jī)制和防治研究開啟了新的窗口。研究表明，腸道屏障穩(wěn)態(tài)變化與心血管疾病的轉(zhuǎn)歸有著密切關(guān)聯(lián)性[1]，且本課題組前期研究表明清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方具有顯著的降壓效果[2]，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探索清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方的降壓效應(yīng)是否與調(diào)節(jié)腸道屏障功能相關(guān)，為其臨床推廣應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2 藥物與試劑

WKY 大鼠18 只，SHR 大鼠54 只，雄性，4 周齡，SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

QYQ 購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰尽？驳厣程辊テ? mg）：國藥準(zhǔn)字J20150085，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社。異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖（FITCdextran，F(xiàn)D4）購自美國Sigma 公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)：Roche 公司；冰凍切片機(jī)：Leica 公司；正置顯微鏡：Leica 公司；熒光分光光度計(jì)：Bio-Tek公司。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將SHR 大鼠隨機(jī)分為模型組、清肝益腎袪風(fēng)復(fù)方組（QYQ）、坎地沙坦酯片組（Can），以同周齡WKY 雄性大鼠為正常對(duì)照組，每組18只。QYQ 組（川芎15 g、柴胡15 g、黃連6 g、羌活15 g、防風(fēng)15 g、夏枯草30 g、川牛膝15 g、黃精15 g、石決明20 g、炒黃芩15 g、桑寄生15 g、益母草30 g）各藥材采用中藥常規(guī)煎煮法，按照人體劑量6.3 倍換算后濃縮灌胃；坎地沙坦酯片用pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，按照人體劑量換算以1 mg·kg-1的劑量灌胃，給藥體積2 mL，每日1 次；空白對(duì)照組和模型組給予等體積飲用水。每組大鼠在4周齡時(shí)開始灌胃，取6只持續(xù)給藥至8周齡，6只持續(xù)給藥至12周齡，6只持續(xù)給藥至20周齡。

1.5 腸道滲透性檢測(cè)

將12 周齡和20 周齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h，次日給各組大鼠稱重，將FITC-dextran 溶解于PBS 中，用44 mg/100 g 的濃度給大鼠灌胃，4 小時(shí)后眼眶內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，4℃避光保存，用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)528 nm)測(cè)量血清吸光度值。

1.6 動(dòng)物處理及組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于8 周齡、12 周齡及20 周齡時(shí)取材，小心將遠(yuǎn)端回腸和近端結(jié)腸取出，分別縱向剖開，一分為二，一份放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行H&E 染色和Masson's trichrome 染色觀察病理形態(tài)學(xué)的改變，利用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析；一份液氮速凍，用于總RNA抽提。

1.7 基因表達(dá)檢測(cè)

將液氮速凍的回腸和結(jié)腸組織進(jìn)行RNA 抽提，隨后用PCR 定量測(cè)試儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再用RT-PCR 法檢測(cè)各基因的表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物列表

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若符合正態(tài)分布和方差齊性，多組比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)，對(duì)有序分類資料進(jìn)行Ridit 分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清肝益腎袪風(fēng)復(fù)方顯著降低20 周齡SHR 大鼠腸道滲透性

如圖1 所示，12 周齡時(shí)，與WKY 組相比，模型組SHR 大鼠血清FITC-dextran 濃度顯著升高（P＜0.05）。與SHR 模型組相比，Can 組與QYQ 治療組大鼠血清FITC-dextran濃度有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

20周齡時(shí)，與WKY 組相比，模型組SHR 大鼠血清FITC-dextran 濃度顯著升高（P＜0.05）；與模型組SHR大鼠相比，Can 組大鼠血清FITC-dextran 濃度無明顯差異；QYQ 治療組血清FITC-dextran 濃度顯著降低（P＜0.05）。QYQ 治療組與Can 組相比，血清FITCdextran濃度顯著降低（P＜0.05）。

圖1 QYQ顯著降低20周齡SHR大鼠腸道滲透性

2.2 清肝益腎袪風(fēng)復(fù)方顯著改善SHR 大鼠回腸及結(jié)腸病理損傷

根據(jù)回腸及結(jié)腸損傷受累面積、損傷程度等，分別標(biāo)記－、±、++、+++、++++，其中－代表無明顯損傷，++++為存在極重度損傷。

如圖2 所示，8 周齡WKY 組，SHR 模型組，Can 組及QYQ 治療組回腸結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理性改變。12 周齡WKY 組回腸結(jié)構(gòu)完整，SHR 模型組回腸壁絨毛壞死，Can組回腸壁粘膜表面局部糜爛，QYQ治療組未見明顯異常。與WKY 組比較，SHR 模型組回腸組織病理損傷評(píng)分高于WKY 組，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與SHR模型組比較，Can 組及QYQ 治療組回腸組織病理損傷評(píng)分低于SHR 模型組，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2A）。20 周齡回腸，WKY組回腸結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理性改變，SHR 模型組回腸壁局部粘膜上皮壞死脫落糜爛形成，Can 組回腸粘膜較大面積淺潰瘍形成，粘膜層顯著充血水腫、炎細(xì)胞浸潤，QYQ 治療組偶見微小粘膜表面糜爛。與WKY 組比較，SHR 模型組回腸組織病理損傷評(píng)分高于WKY 組（P＜0.05）；與SHR 模型組比較，Can 組與QYQ 治療組回腸組織病理損傷評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）（表2B）。

表2 A 12周齡各組大鼠回腸損傷評(píng)分

表2B 20周齡各組大鼠回腸損傷評(píng)分

表2 C 12周齡各組大鼠結(jié)腸損傷評(píng)分

表2D 20周齡各組大鼠結(jié)腸損傷評(píng)分

8 周齡結(jié)腸WKY 組，SHR 模型組，Can 組及QYQ治療組結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理性改變；12 周齡結(jié)腸，WKY 組結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，SHR 模型組結(jié)腸壁粘膜層表面糜爛，Can 組結(jié)腸壁粘膜層及粘膜下層輕度水腫，QYQ 治療組結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整；與WKY 組比較，SHR模型組結(jié)腸組織病理損傷評(píng)分顯著高于WKY 組（P＜0.05），與SHR 模型組比較，Can 組及QYQ 組結(jié)腸組織病理損傷評(píng)分無明顯差異（表2C）。20 周齡結(jié)腸，WKY 組結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理性改變，SHR 模型組結(jié)腸壁粘膜表面糜爛，滲出壞死組織覆蓋，Can組結(jié)腸壁多發(fā)粘膜表面糜爛、充血水腫，QYQ 結(jié)腸壁小潰瘍形成，潰瘍周邊上皮細(xì)胞和纖維組織增生修復(fù)。與WKY 組比較，SHR 模型組結(jié)腸組織病理損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.05），與SHR 模型組比較，QYQ 治療組結(jié)腸組織病理損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.05），SHR 模型組與Can組比較無明顯差異（表2D）。

圖2 不同周齡大鼠回腸、結(jié)腸H&E染色（×200）

2.3 清肝益腎袪風(fēng)復(fù)方顯著抑制20 周齡SHR 大鼠回腸及結(jié)腸組織纖維化形成

與8 周齡、12 周齡及20 周齡WKY 大鼠回腸和結(jié)腸組織纖維化相對(duì)面積比較，SHR 模型組纖維化相對(duì)面積顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在8周齡及12 周齡，與SHR 模型組相比，Can 組及QYQ 治療組回腸及結(jié)腸纖維化相對(duì)面積無明顯差異；20 周齡，與SHR 模型組纖維化相對(duì)面積比較，QYQ 治療組回腸及結(jié)腸纖維化面積顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），且QYQ 治療組結(jié)腸纖維化面積顯著低于Can 組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

2.4 清肝益腎袪風(fēng)復(fù)方顯著升高20 周齡SHR 大鼠回腸、結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)

如圖4A 所示，與WKY 組相比，8 周齡SHR 模型組大鼠回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達(dá)無明顯差異；與SHR模型組比較，Can組回腸Cgn，Tjp1 mRNA表達(dá)無差異，Ocln mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組及Can 組比較，QYQ 治療組回腸Cgn mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Tjp1 mRNA 表達(dá)無明顯差異；與SHR 模型組比較QYQ 治療組回腸Ocln mRNA 表達(dá)無明顯差異，與Can 組比較表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 不同周齡大鼠腸道Masson's trichrome染色（×400）

圖4 不同周齡大鼠腸道緊密連接蛋白mRNA表達(dá)

如圖4B 所示，與WKY 組相比，20 周齡時(shí)SHR 模型組大鼠回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 和Tjp1 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組相比，Can 組大鼠回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達(dá)無差異，Tjp1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與SHR 模型組及Can 組比較，QYQ 治療組回腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Tjp1 mRNA表達(dá)與模型組比顯著升高（P＜0.05）。

如圖4C 所示，與WKY 組相比，8 周齡SHR 模型組大鼠近端結(jié)腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組比較，Can 組大鼠近端結(jié)腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 及Tjp1 mRNA 表達(dá)無差異；與SHR 模型組及Can 組比較，QYQ 治療組近端結(jié)腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 及Tjp1 mRNA 表達(dá)無差異。

如圖4D 所示，與WKY 組相比，20 周齡時(shí)SHR 模型組大鼠近端結(jié)腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln 和Tjp1 mRNA 顯著降低（P＜0.05）；與SHR 模型組相比，Can組大鼠近端結(jié)腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln mRNA 表達(dá)無差異，Tjp1 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與SHR模型組及Can 組比較，QYQ 治療組近端結(jié)腸緊密連接蛋白Cgn，Ocln及Tjp1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

腸道是人體最大的免疫器官，腸粘膜上皮由單層細(xì)胞組成，對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用，既作為物理屏障，又作為免疫防御屏障[3]。腸道屏障功能受損與許多疾病狀態(tài)有關(guān)，包括腸道和全身。由于屏障功能障礙引起的腸通透性增加可能導(dǎo)致微生物移位[4]?？赡芤鸶鞣N疾病的低度炎癥[5]。

FITC-dextran 是反映腸道對(duì)大分子物質(zhì)滲透性的指標(biāo)，用來評(píng)估腸上皮組織的緊密連接損傷。本課題組通過檢測(cè)血清FITC-dextran 濃度發(fā)現(xiàn)，相比WKY 組大鼠，SHR 模型組大鼠腸道滲透性顯著升高，QYQ 具有顯著干預(yù)高血壓相關(guān)腸道滲透性的改變。同時(shí)本課題組研究發(fā)現(xiàn)與20 周齡WKY 組相比，SHR 模型組回腸結(jié)腸粘膜表面糜爛明顯，組織病理損傷評(píng)分顯著升高及纖維化相對(duì)面積顯著升高（P＜0.05）。而QYQ治療組回腸結(jié)腸組織病理損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.05），腸道炎癥情況顯著改善，同時(shí)20周齡QYQ 治療組回腸及結(jié)腸纖維化面積與SHR 模型組比較顯著降低（P＜0.05），提示QYQ 對(duì)高血壓相關(guān)回腸及結(jié)腸組織損傷具有顯著的干預(yù)效應(yīng)。

緊密連接（Tight junctions，TJS）是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮生理功能的基本結(jié)構(gòu)[6]。腸道上皮細(xì)胞通過緊密連接等結(jié)構(gòu)形成屏障，維持人體健康[7]。在正常腸上皮組織中，扣帶蛋白（Cingulin，Cgn）和閉合蛋白（Occludin，Ocln）等緊密連接蛋白構(gòu)成緊密連接，對(duì)維持上皮結(jié)構(gòu)和功能的完整及細(xì)胞的生長(zhǎng)，代謝起重要作用[8]。緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的改變，緊密連接中斷，是腸黏膜屏障損傷和腸滲透性增加的一個(gè)關(guān)鍵因素[9]，調(diào)節(jié)上皮緊密連接蛋白可加強(qiáng)上皮屏障功能的恢復(fù)[7,10]。

腸道物理屏障由腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間的連接組成，以Cgn、Ocln 及 緊密 連 接 蛋 白1（Tight junction protein1，Tjp1）為代表的緊密連接蛋白是腸道物理屏障的重要組成部分，腸屏障功能破壞，其結(jié)果將導(dǎo)致腸道內(nèi)的細(xì)菌及毒素入血，加重全身炎癥反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)緊密蛋白的表達(dá)和定位來調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的屏障功能是治療一些疾病的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)[11]。

本課題組分析了不同周齡大鼠及藥物干預(yù)后腸緊密連接蛋白mRNA 的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比WKY 大鼠，20 周齡SHR 模型組大鼠的回腸及結(jié)腸的相關(guān)緊密連接蛋白mRNA 表達(dá)顯著降低，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。經(jīng)QYQ 治療可以顯著增加20 周齡SHR 大鼠腸緊密連接蛋白Cgn、Ocln 及Tjp1 mRNA表達(dá)水平。

綜上所述，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方對(duì)高血壓相關(guān)腸道屏障功能失調(diào)的干預(yù)效應(yīng)可能與其調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。