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        基于PEG-PLGA和CMCS載體制備白藜蘆醇納米粒在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用*

        2019-01-18 11:04:40王耀文張雪瓊馬靜靜湯明秀李佳明
        關(guān)鍵詞:結(jié)腸癌

        王耀文,張雪瓊,馬靜靜,湯明秀,李佳明,邱 彤**

        (1. 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院 武漢 430070;2. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院胃腸科 武漢 430060;3. 武漢理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料與工程中心 武漢 430070)

        結(jié)直腸癌(CRC)作為消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,已成為世界上第二大癌癥相關(guān)死亡原因[1,2]。目前,化療是結(jié)直腸癌最常見的治療方法之一,奧沙利鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣(5-FU/LV)作為晚期CRC 的標(biāo)準一線化療藥物,已廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌臨床治療[3,4]。然而,長期使用化療藥物會引起一系列的副作用,如耐藥性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制和肝毒性等[5]。因此,一些低毒高效的天然化合物逐漸成為結(jié)腸癌治療的研究熱點[6]。白藜蘆醇(RES)是從葡萄、漿果、花生和紅酒中提取的一種天然多酚化合物,由于其抗氧化、抗衰老、抗腫瘤活性以及心血管和神經(jīng)保護作用,近年來引起了人們的廣泛關(guān)注[7-9]。已有研究證明RES 預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生的能力與抑制腫瘤細胞周期和誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞死亡有關(guān)[10,11]。Jeong 等研究者發(fā)現(xiàn)RES 可通過分子靶點TCF4 誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞凋亡[12]。DeMoulin 表明RES 可通過調(diào)整拓撲異構(gòu)酶II 誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞DNA 損傷[13]。然而,由于RES 的溶解性差、生物利用度低、代謝快、光敏性差等缺點,其在體內(nèi)外都難以發(fā)揮良好的生物活性[14]。納米給藥系統(tǒng)(NDDs)在提高親脂性藥物生物利用度方面具有巨大的潛力[15-17]。越來越多的載體被廣泛地應(yīng)用于控釋或靶向給藥系統(tǒng),包括可溶性聚合物、脂質(zhì)體、微球和納米粒子(NPs)。NPs 可以攜帶藥物在其內(nèi)部或附著在其表面,從而實現(xiàn)被動或主動靶向給藥。NPs 通過增強滲透和滯留(EPR)效應(yīng)在腫瘤部位有效累積,延長藥物在體內(nèi)的半衰期[18]。聚乙丙交酯聚乙二醇共聚物(PEG-PLGA)共聚物作為藥物載體,可保護藥物的降解,并實現(xiàn)藥物的緩釋[19-21]。同時,羧甲基殼聚糖(CMCS))以其優(yōu)異的水溶性、良好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等優(yōu)點,也被廣泛應(yīng)用于納米粒子的研究中[22-24]。

        目前,RES 納米粒在結(jié)腸癌治療中的研究相對較少,本研究采用納米沉淀法和乳化交聯(lián)法分別制備了RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 納米粒子[25,26],并進行了一系列表征。

        1 材料與方法

        1.1 試藥和儀器

        白藜蘆醇(上海阿拉丁試劑有限公司),羧甲基殼聚糖(CMCS)(M=1×104,DD=85%,青島弘海生物技術(shù)有限公司);聚乙丙交酯聚乙二醇共聚物(PEGPLGA)(濟南岱罡生物工程有限公司);尼羅紅(源葉生物技術(shù)科技有限公司);人結(jié)腸腺癌細胞(SW480 細胞)(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司);CCK-8 試劑盒、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Leibovitz's L-15 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素(100 IU·mL-1)、鏈霉素(100 IU·mL-1)和胰蛋白酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

        紫外分光光度計UV-2600(香港島津有限公司);Zetasizer 納米粒度分析儀Nano-ZS90(Malvern);冷凍干燥機FD-1A-50(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);恒溫震蕩箱KDC-ZS90(力康發(fā)展有限公司);酶標(biāo)儀Multiskan GO-1510(Thermo-Scientific);細胞培養(yǎng)箱HF90(力康發(fā)展有限公司);激光共聚焦顯微鏡LabRAM HR800(Horiba Jobin Yvon)

        1.2 納米粒的制備

        1.2.1 RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs的制備

        采用納米沉淀法制備RES-PEG-PLGA NPs。將40 mg PEG-PLGA 和5 mg RES 溶解在300 μL 丙酮中,室溫攪拌下,將丙酮溶液緩慢滴加到4 mL 去離子水中,得到乳狀膠體懸浮液,在室溫下攪拌過夜,待丙酮完全揮發(fā)。將反應(yīng)液以5 000 rpm 轉(zhuǎn)速,離心30 min,除去大顆粒。最后,在16 000 rpm 轉(zhuǎn)速,4℃條件下離心1 h,沉淀用去離子水洗滌3 次。將沉淀層重懸,冷凍干燥,供進一步使用。

        采用乳化交聯(lián)法制備RES-CMCS NPs。用0.3%吐溫溶液配2 mg·mL-1CMCS 溶液,過濾去除溶液中的雜質(zhì)。將5 mg RES溶解在0.2 mL三氯甲烷中,緩慢滴入10 mL CMCS 溶液中,超聲乳化10 min,得到初乳。磁力攪拌下將適量0.5 wt%CaCl2溶液逐滴滴加至乳液中,35℃溫度條件下,磁力攪拌過夜至三氯甲烷完全揮發(fā)。在轉(zhuǎn)速6 000 rpm,離心30 min,去除大顆粒和未包封的RES。最后,將納米粒懸浮液在4℃,16 000 rpm條件下離心1 h。沉淀用去離子水洗滌3 次。將沉淀層重懸,冷凍干燥。

        同時,按照上述方法制備未載藥納米粒PEGPLGA NPs 以及CMCS-NPs,作為空白納米粒,并冷凍干燥,供進一步使用。

        1.2.2 Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs的制備

        用尼羅紅(Nile red)作為熒光探針標(biāo)記納米粒。將50 μL 尼羅紅丙酮溶液(1 mg·mL-1)加入含40 mg PLGA-PEG和5 mg RES的300 μL丙酮溶液中。然后,采用上述納米粒沉淀法制備Nile red-RES-PEGPLGA NPs。將120 uL 1 mg·mL-1尼羅紅溶液(三氯甲烷為溶劑)滴加入已溶解5 mg RES 的0.2 mL 三氯甲烷中,混勻,將有機溶液緩慢滴入CMCS 溶液中,超聲乳化10 min,得到初乳。磁力攪拌下將適量0.5 wt%CaCl2溶液逐滴滴加乳液中,35℃磁力攪拌過夜至三氯甲烷完全揮發(fā)。溶液以6 000 rpm 離心30 min,去除大顆粒和未包封的RES。最后,將納米粒懸浮液以16 000 rpm轉(zhuǎn)速,在4℃條件下離心1 h。沉淀用去離子水洗滌3 次,得到Nile red-RES-CMCS NPs。將Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 懸浮液冷凍干燥,供進一步使用。

        2 RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs的表征

        2.1 粒徑、zeta電位的測定

        粒徑和Zeta 電位通過動態(tài)光散射法(DLS)測量。待測試納米粒子水溶液濃度為1 mg·mL-1,設(shè)置散射角為90°,測試溫度為25℃,每個樣品重復(fù)測試3次。

        2.2 形態(tài)觀察

        將1滴納米粒混懸液(1 mg·mL-1)滴在200目的銅網(wǎng)上,室溫下自然干燥后在透射電鏡(TEM)下觀察。

        2.3 包封效率(EE)和載藥量(DL)的測定

        用紫外可見光譜法測定了納米粒子的包封率和載藥量。將1 mg RES-PEG-PLGA NPs 粉末溶于1 mL DMF 中,對有機溶液定量稀釋,進行含量測定。另外,

        表1 平均粒徑(PS)、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位(n=3,±s)

        表1 平均粒徑(PS)、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位(n=3,±s)

        Batch RES-PEG-PLG NPs RES-CMCS NPs PEG-PLGA NPs CMCS NPs PS/nm±SD 78.67±1.0 231.5±1.6 70.40±0.98 229.9±1.4 PDI±SD 0.15±0.01 0.09±0.01 0.16±0.01 0.10±0.01 Zata/mV±SD-5.86±0.95-14.4±0.5-4.31±0.85-13.2±0.5

        1.2.1 中攪拌過夜的10 mL RES-CMCS NPs 溶液在6 000 rpm 轉(zhuǎn)速、4℃下離心30 min,沉淀用去離子水沖洗兩次。沉淀用DMF 完全溶解,定量稀釋,在306 nm處用紫外可見光譜法對上述兩種稀釋溶液進行分析,并參照校準曲線(標(biāo)準溶液范圍為2-20 μg/mL,R2=0.9992)計 算。 EE% 和DL% 按下列公式計算,(1)和(2):

        2.4 RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 體外釋藥研究

        采用動態(tài)透析法測定兩種納米粒以及游離RES(free RES)的體外釋藥情況。制備了兩種不同pH(pH7.4 和pH5.8)的磷酸緩沖液(PBS)作為釋放介質(zhì),精確稱取RES 原藥以及納米粒子凍干粉,分別溶解于5 mL 緩沖液中,裝入透析袋(MWCO3500),扎緊后置于50 mL PBS 中,在(37±0.5)℃、100 r·min-1條件下恒溫振蕩,定時取樣,并立即補加相同量的釋藥介質(zhì)。樣品過濾后用紫外可見光譜法測定白藜蘆醇的含量,計算累積釋放量。

        2.5 體外抗腫瘤活性研究

        以SW480結(jié)腸癌細胞為研究對象,運用CCK-8檢測法考察納米粒子對結(jié)腸癌細胞的抗增殖活性,從而評價其體外抗腫瘤的作用。取對數(shù)生長期的SW480細胞,用PBS 洗滌兩遍以后,經(jīng)胰蛋白酶消化,離心后在細胞培養(yǎng)液中重懸。將SW480 細胞懸液接種于96孔(5 000個細胞/孔)培養(yǎng)板中,于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h,使細胞貼壁。每孔分別用不同濃度(0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1的RES)RES-PEGPLGA NPs 和RES-CMCS NPs 孵育24 h 和48 h。同時用不同濃度(0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1的藥物載體)的空白納米粒子PEG-PLGA NPs 和CMCS NPs 孵育24 h、48 h。每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 和48 h后,棄去培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)基洗滌3次。每孔加入100 μL 培養(yǎng)液(10%CCK-8,90%培養(yǎng)液),繼續(xù)孵育4 h,用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測定光密度值(OD),細胞活力可根據(jù)下列公式計算,(3):

        2.6 體外細胞攝取研究

        用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)研究了納米粒子在SW480 細胞中的攝取。將SW480 細胞分別接種于共聚焦培養(yǎng)皿中(1 × 106個細胞/孔),用2 mL 培養(yǎng)液孵育24 h。棄去培養(yǎng)液,加入分別含Nile red-RESPEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 的 培養(yǎng) 液2 mL(Nile red濃度為5 μg·mL-1),于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5、1、2 和4 h。在規(guī)定時間間隔內(nèi),棄去培養(yǎng)液,用PBS 洗滌3 次。用4%甲醛固定20 min后,用PBS 洗滌3 次。隨后,用適量的DAPI 處理細胞15 min,用PBS 洗滌3 次。用CLSM 技術(shù)觀察細胞熒光圖像。

        3 結(jié)果和討論

        3.1 平均粒徑(PS)、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位

        RES-PEG-PLGA NPs 的 平均 粒 徑為78.67 ± 1.0 nm,PDI 為0.15 ± 0.01。RES-CMCS NPs 的平均粒徑為231.5±1.6 nm,PDI為0.09±0.01(表1)。兩種納米粒子分散體系均為典型的單分散體系,在圖1 中呈單峰分布。RES-PEG-PLGA NPs 的粒徑明顯小于RESCMCS NPs,這可能是由于PEG-PLGA 兩親性共聚物能夠在水中自組裝形成粒徑較小的膠束納米粒子[27]。

        3.2 形態(tài)觀察

        圖3 為RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs的TEM 圖,均呈圓形或者類圓形,透射電鏡下,RESPEG-PLGA NPs 粒徑約為60 nm,RES-CMCS NPs 粒徑約為180 nm。兩者均小于DLS 法測得的平均粒徑??赡苁且驗門EM 法是在干燥狀態(tài)下測定粒徑,而DLS法是在水溶液中測定,會受到溶脹效應(yīng)的影響。

        3.3 包封效率(EE)和載藥量(DL)的測定

        依據(jù)2.3 方法測定RES-PEG-PLGA NPs 和RESCMCS NPs 的包封效率(EE)和載藥量(DL),結(jié)果如表2所示,

        圖1 粒徑分布(A)Res-PEG-PLGA NPs和(B)Res-CMCS NPs

        圖3 RES在306 nm處的標(biāo)定曲線

        圖4 體外藥物釋藥曲線

        表2 包封效率(EE)和載藥量(DL)

        3.4 體外釋藥研究

        圖5 為RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs在兩種不同釋藥介質(zhì)中的累積釋放曲線。根據(jù)圖4的校準曲線計算,在2 h,游離RES 的累積釋放量達到了約55%,RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 的釋放量分別約為15%和34%。在4h,游離Res 釋放量達到了70%,RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 的釋放量分別是32%和40%,結(jié)果表明兩種納米粒均具有一定的緩釋作用,能顯著延長RES 的釋藥時間,從而達到提高RES生物利用度的目的。

        圖5 不同濃度(0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1)游離RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PLGA NPs、CMCS NPs、PEG-PLGA NPs對SW480細胞活力的影響。將S W480細胞孵育24 h,用CCK-8法測定細胞活力。

        圖6 不同濃度(0.1、0.5、5、10、20、40 μg·mL-1)free RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PLGA NPs、CMCS NPs、PEG-PLGA NPs對SW480細胞活力的影響。將SW480細胞孵育48 h,用CCK-8法測定細胞活力

        表3 RES-PEG-PLGA NPs和RES-CMCS NPs對SW480細胞的IC50值

        3.5 體外細胞毒性

        采用CCK-8法檢測空白納米粒子,游離RES 以及載藥納米粒子對SW480細胞體外細胞毒性。如圖5和圖6 所示,不同濃度的空白納米粒PEG-PLGA NPs,CMCS NPs 對SW480 細胞幾乎無毒性,該結(jié)果表明,CMCS 和PEG-PLGA 具有良好的生物相容性,可以用作理想的藥物載體。當(dāng)20 μg·mL-1游離RES、RESCMCS NPs和RES-PEG-PLGA NPs分別與SW480細胞孵育24 h 后,細胞存活率分別為61.84%、57.36%和8.73%。當(dāng)濃度增加到40 μg·mL-1時,RES-CMCS NPs和RES-PEG-PLGA NPs 的細胞存活率分別下降到16.25%和6.13%。與游離藥物相比較,RES-CMCS NPs 和RES-PEG-PLGA NPS對SW480 細胞表現(xiàn)出較高的細胞增殖抑制作用,并且對腫瘤細胞的抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。同時,這些結(jié)果也表明,相 比RES-CMCS NPs,RES-PEG-PLGA NPS對SW480 細胞表現(xiàn)出更高的細胞毒性。這可能是由于納米粒徑大小之間的顯著差異,RES-PEG-PLGA NPs粒徑為78.67 ± 1.0 nm,與RES-CMCS NP(S231.5 ± 1.6 nm)相比,更易于被細胞攝??;另一方面,帶有表面負電荷的CMCS與攜帶負電荷的腫瘤細胞膜之間的排斥作用可能導(dǎo)致納米粒子在細胞內(nèi)的攝取減少。

        半數(shù)抑制濃度(IC50)計算結(jié)果如表3 所示,與SW480 細胞孵育24 h,游離RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PL GANPs的IC50值分別為24.03 μg·mL-1、20.83 μg·mL-1和7.51μg·mL-1;孵育48 h 后,游離RES、RES-CMCS NPs、RES-PEG-PLGA NPs 對 應(yīng) 的IC50值為20.81 μg·mL-1,3.27 μg·mL-1和1.47 μg·mL-1。結(jié)果表明,與游離RES 相比,RES-PEG-PLGA NPS和RES-CMCS NPS提高了RES 對結(jié)腸癌細胞的殺傷效率。

        3.6 體外細胞攝取研究

        用CLSM 研 究Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 分別與SW480 細胞孵育0.5、1、2、3 和4 h 后的細胞攝取。細胞核經(jīng)DAPI 染色后呈藍色熒光,熒光素尼羅紅呈紅色熒光。如圖7 和圖8所示,孵育0.5 h 和1 h 后,Nile red-RES-PEG-PLGA NPs 和Nile red-RES-CMCS NPs 組中細胞胞質(zhì)和細胞核周圍呈現(xiàn)微弱的紅色熒光,繼續(xù)培養(yǎng)2h 后,紅色熒光明顯增強。當(dāng)孵育4 h 后,Nile red-RES-PEGPLGA NPs 組細胞核內(nèi)的熒光強度明顯高于Nile red-RES-CMCS NPs 組。原因可能是與Nile red-RESCMCS NPs 相比,粒徑較小的Nile red-RES-PEGPLGA NPs 更容易被SW 480 細胞攝??;同時,Nile red-RES-CMCS NPs表面的負電荷可能通過排斥作用阻礙納米粒在細胞中的攝取。這個結(jié)果與上述3.5 細胞毒性結(jié)果是一致的。圖7 和圖8 結(jié)果表明,這兩種納米藥物給藥系統(tǒng)在SW480 細胞中均可以有效內(nèi)化并持續(xù)保留。

        圖7 RES-CMCS NPs的體外細胞攝取

        圖8 RES-PEG-PLGA NPs的體外細胞攝取

        4 總結(jié)

        報道表明,用傳統(tǒng)的化學(xué)療法治療惡性腫瘤時,小分子藥物很容易被腎清除并在體內(nèi)呈現(xiàn)非特異性分布,這樣抗腫瘤藥物就很難到達腫瘤部位;為了達到治療濃度,抗腫瘤藥物濃度被提高,這相應(yīng)也會帶來一系列的臨床毒副作用[28]??紤]到以上情況,本文以生物相容性良好的CMCS 和PEG-PLGA 作為載體,成功制備了RES-PEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs。綜合實驗結(jié)果表明,兩種納米給藥系統(tǒng)RES-PEGPLGA NPs 和RES-CMCS NPs 對RES 均表現(xiàn)出較高的載藥能力,分別為87%和60%。同時RES-PEG-PLGA NPs 表現(xiàn)出良好的平均水動力直徑78.67±1.0 nm,可在實體腫瘤中被動聚集,通過增強通透性及滯留效應(yīng)(EPR)增強藥物的細胞毒性。與游離RES 相比,RESPEG-PLGA NPs 和RES-CMCS NPs 具有明顯的緩釋作用,同時可被SW480 細胞有效內(nèi)化并抑制細胞增殖。另外,Yang S 等研究發(fā)現(xiàn)100 μM RES 作用于人結(jié)腸癌細胞HT29 細胞24 h 后,使HT-29 細胞的增殖減少了45.9%[29]。王純忠等研究也表明RES 可誘導(dǎo)SW480細胞凋亡,將細胞阻滯于G1 期,其研究結(jié)果顯示游離RES作用于SW480細胞24 h,IC50值為43.66 μg·mL-1;作用48 h,IC50 值為26.81 μg·mL-1[30]。而本課題實驗結(jié)果表明,游離RES 與SW480 細胞共孵育24 h 和48 h后,其IC50 值分別為24.03 μg·mL-1和20.81 μg·mL-1;而RES 納米粒子與SW480 細胞共孵育24 h 和48 h后,其IC50 值最低分別降低 至7.51 μg·mL-1和1.47 μg·mL-1,大大降低了RES 抗結(jié)腸癌治療濃度。結(jié)合文獻報道和本研究結(jié)果表明,RES 納米粒子增加了水難溶性RES 的溶解度,增強了RES 對結(jié)腸癌細胞增殖的抑制作用,達到了藥物緩釋效果,提高了RES的生物利用度,為臨床結(jié)腸癌治療提供了一定的實驗依據(jù),同時也證明了納米藥物傳遞系統(tǒng)在腫瘤治療有良好的應(yīng)用前景。

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