王穎超，劉運(yùn)華，張豐豐，趙 敬，楊 敏＊＊，趙宗江＊＊

（1. 北京航天總醫(yī)院 北京 100007；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029；3. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志 北京 100700）

據(jù)一項權(quán)威的流行病學(xué)調(diào)查報告顯示，我國糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）患者的總數(shù)高達(dá)1.14 億之多，已經(jīng)達(dá)到了世界的糖尿病患者總?cè)藬?shù)的1/3[1]，DM對人類健康的危害和世界經(jīng)濟(jì)造成的損失不亞于腦血管疾病、惡性腫瘤。 糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是DM 長期損害機(jī)體伴發(fā)的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，隨著病情的進(jìn)展，最終一步步惡化為終末期腎病，導(dǎo)致患者不得不依靠透析來維持生命[2,3]。因此，全球醫(yī)學(xué)界DM 研究領(lǐng)的重難點(diǎn)之一便是DN，而深入研究DN 的發(fā)病機(jī)制，探求有效的防治的方法對于攻克DN 來說，具有重要的研究意義和研究價值。病理研究顯示，DN 的主要病理改變是腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。不少針對足細(xì)胞的研究表明，足細(xì)胞的損傷和凋亡對DN 腎小球硬化和間質(zhì)纖維化病變有著至關(guān)重要的影響[4]。大量研究顯示磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide 3 Kinese/Protein KinaseB，PI3K/AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在體內(nèi)的抗凋亡過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，而PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活又依賴于nephrin-CD2AP 復(fù)合體的作用[5]。

糖腎平在多年臨床DN 的預(yù)防和治療中展現(xiàn)出了顯著的療效，它是依據(jù)趙宗江教授多年來研究文獻(xiàn)資料并在大量臨床基礎(chǔ)上提出的DN“腎痿”理論所組建的[6]。并且，我們課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究證明，糖腎平能通過影響各種信號通路途徑保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障的正常功能，減輕甚至逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的損傷，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[7-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究糖腎平對DN 大鼠足細(xì)胞凋亡的影響和對通過PI3K/AKT通路抗凋亡通路的機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

74 只清潔級雄性Wistar 品種大鼠，體重（200 ±20）g，購自北京華阜康生物股份有限責(zé)任公司（許可證編號：SCXK京2009-0007）。

1.2 藥物及試劑

厄貝沙坦片（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批號：J20080061）；糖腎平（組成：生黃芪6 g、水蛭2 g、山萸肉2 g、熟地黃3 g、地骨皮3 g、丹皮3 g，批號：2006008，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制劑室制備）；鏈脲佐菌素（批號：S0130，Sigma 公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：1168481791，中杉金橋公司）；胰蛋白酶（批號：41500-067，Gibco 公司）；DAB（批號：CW0125A，康為世紀(jì)生物科技有限公司）；Triton（批號：9002-93-1，Sigma）；PI3K（批號：2382072，Monoclonal 公司）；AKT（產(chǎn)品批號：4691，Cell Signaling Technology 公司）；Bad（批 號：ab62465，Abcam Technology 公司）；山羊血清封閉液（批號：120312，中杉金橋公司）；GFVisionTM Ⅱ抗（批號：2013102801，上海基因科技有限公司）；A3500（批號：00000541604，Promega公司）；Marker（批號：071513，賽百盛基因技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器

普通顯微鏡（日本Olympus 公司，型號L340099），電熱恒溫培養(yǎng)箱20-60℃（湖北省黃石市醫(yī)療器械廠，型號skp-01），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號Gel Doc XR+），PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號T100），電源（美國Bio-Rad 公司，型號041BR111842），Image J圖像分析軟件。

2 方法

2.1 動物模型制備與分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)購買的74只Wistar大鼠1周，根據(jù)體質(zhì)量按照隨機(jī)數(shù)字表法分為10只正常組和64只造模組。通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確立STZ 的注射劑量為45 mg·kg-1，按照此用藥標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（用檸檬酸緩沖液配STZ 為1%的溶液，放置在冰上用鋁箔紙遮蓋避光，時間不超過30 min），建立DKD 動物模型。72 h 后分別采取尾靜脈取血法和代謝籠法檢測大鼠血糖和尿糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1和尿糖4 個“＋”為糖尿病大鼠造模的成功標(biāo)準(zhǔn)[5]。然后把造模成功的大鼠再按照每組16 只得標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組、糖腎平小劑量組和糖腎平大劑量組。按照人臨床用藥劑量和1 mL/100 g體質(zhì)量系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)換算灌胃藥量，確立糖腎平小劑量組0.525 g·kg-1、大劑量組2.1 g·kg-1和厄貝沙坦組17.5 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)每日灌胃，模型組給與等量生理鹽水，全部大鼠均按每籠不超過6 只得標(biāo)準(zhǔn)分籠飼養(yǎng)在潔凈動物櫥，采用普通大鼠飼料喂養(yǎng)，用標(biāo)準(zhǔn)水瓶給予飲水，每日更換木質(zhì)墊料及打掃潔凈動物房。

2.2 觀察指標(biāo)及測定

2.2.1 一般情況

每天按時觀察并且記錄大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)色彩和光澤度、飲食飲水量大小的變化以及二便及活動情況等，每周一對大鼠進(jìn)行體質(zhì)量測定。

2.2.2 TUNEL染色

從-20℃取出切片，4℃30 min，室溫30 min；常規(guī)脫蠟至水，同HE 染色，0.5%胰蛋白酶37°C 40 min，滴加TUNEL 37°C 80 min；（陰性對照組：加50 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP 液即試劑2；陽性對照組：加反應(yīng)混合液。試劑1∶試劑2 = 1∶20；現(xiàn)配現(xiàn)用），滴 加50 μL converter-POD 37℃50 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染2 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。

2.2.3 免疫組化檢測大鼠腎組織中PI3K、AKT、Bad蛋白表達(dá)情況

取4℃保存的石蠟切片，復(fù)溫半小時后石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，Triton、CH3OH-H2O2分別孵育10 min；使用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)；蛋清、山羊血清進(jìn)行封閉，滴加稀釋好的一抗（WT-1 濃度為1∶200，PI3K 濃度為1∶100，AKT 濃度為1∶200，Bad 濃度為1∶1200，陰性對照組加PBS），把濕盒放于冰箱中4℃過夜，第二日復(fù)溫后滴加HRP標(biāo)記二抗，紗布擦干后DAB顯色3 min，在蘇木素染缸中復(fù)染后流水沖洗返藍(lán)10 min，最后中性樹膠封片。

2.2.4 大鼠腎組織PI3K、AKT、Bad、CD2AP 及nephrin mRNA的表達(dá)

RT-PCR 檢測上述指標(biāo)的mRNA 的表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

免疫組化用Image-pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析，在40 倍物鏡下，每組記數(shù)20 個腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)目，取平均數(shù)；TUNEL 染計數(shù)每張圖片中陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計算調(diào)亡百分率（Apoptotic index，AI）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用ImageJ 圖像分析軟件，進(jìn)行圖像分析。所有統(tǒng)計用均采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示；采χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀況

對大鼠進(jìn)行STZ 腹腔注射72 h 后，模型組大鼠開始逐漸有多飲、多食、多尿、形體消瘦的變化，模型組在第6周后體重明顯下降、皮毛干枯并且動作遲緩；部分大鼠還出現(xiàn)了尿路感染、白內(nèi)障等多種糖尿病并發(fā)癥。到14 周末取材為止共死亡5 只大鼠，治療組大鼠的一般狀態(tài)均有不同程度的改善。

3.2 糖腎平對STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠腎小球細(xì)胞凋亡的影響

通過TUNEL檢測計算細(xì)胞凋亡率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組腎小球內(nèi)細(xì)胞調(diào)亡較少；與正常組相比，模型組細(xì)胞調(diào)亡率明顯增加，有顯著性差異（P＜0.01）。厄貝沙坦組及糖腎平治療組的細(xì)胞調(diào)亡率與模型組相比顯著降低（P＜0.01）（表2，圖1，圖2）。與正常組相比，模型組腎小球足細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P＜0.01）；而經(jīng)過厄貝沙坦組及糖腎平，厄貝沙坦組及糖腎平治療組足細(xì)胞數(shù)量明顯增加（表2，圖1，圖2）。

表2 糖腎平對STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎小球細(xì)胞凋亡率的影響（AI，±s）

表2 糖腎平對STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎小球細(xì)胞凋亡率的影響（AI，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F足細(xì)胞數(shù)18.6±0.72**8.5±0.51 11.3±0.62**11±0.46**12.4±0.7**10.31 AI 0.16±0.012**0.52±0.042 0.35±0.045**0.31±0.022**0.26±0.015**18.31

圖1 腎組織TUNEL染色（TUNEL×400）

圖2 腎組織免疫組化WT-1蛋白表達(dá)（IHC×400）

3.3 糖腎平對STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠腎組織中PI3K、AKT、Bad蛋白表達(dá)的影響

正常組大鼠的腎小球內(nèi)PI3K、AKT 表達(dá)較多，Bad蛋白表達(dá)減少與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），厄貝沙坦組、糖腎平大劑量組PI3K 蛋白表達(dá)增多，糖腎平大劑量組AKT 蛋白表達(dá)增多，與模型組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），糖腎平小劑量組PI3K、AKT 蛋白表達(dá)增多有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）與模型組比較，厄貝沙坦組及糖腎平各治療組Bad 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01）（表3，圖3，圖4，圖5）。

表3 糖腎平對STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、Bad的影響（OD，±s）

表3 糖腎平對STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、Bad的影響（OD，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。a 正常組；b 模型組；c 厄貝沙坦組；d 糖腎平小劑量組；e 糖腎平大劑量組；f陰性對照組

組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F AKT 0.539±0.013**0.468±0.012 0.491±0.006 0.498±0.007*0.511±0.007**7.49 PI3K 0.48±0.014**0.39±0.012 0.44±0.012**0.42±0.012*0.47±0.012**9.87 Bad 0.182±0.009**0.303±0.012 0.239±0.006**0.246±0.024**0.218±0.007**10.84

圖3 腎組織免疫組化PI3K蛋白表達(dá)（IHC×400）

圖4 腎組織免疫組化AKT蛋白表達(dá)（IHC×400）

圖5 腎組織免疫組化Bad蛋白表達(dá)（IHC×400）

3.4 糖腎平對STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠腎組織中nephrin、CD2AP、PI3K、AKT、BadmRNA表達(dá)的影響

正常大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、PI3K、AKTmRNA呈高表達(dá)，而BadmRNA 少量表達(dá)；DN 大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、PI3K、AKTmRNA 表達(dá)明顯減少（P＜0.01），BadmRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，厄貝沙坦組腎組織中CD2AP、nephrinmRNA表達(dá)增多（P＜0.01，P＜0.05）；PI3K、AKTmRNA 表達(dá)增多（P＜0.05）；BadmRNA 表達(dá)明顯減少（P＜

0.01）。與模型組相比，糖腎平大劑量組腎組織中CD2AP、nephrin、AKTmRNA 表達(dá)增多（P＜0.01）；BadmRNA 表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；PI3KmRNA 表達(dá)增多但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。糖腎平小劑量組腎組織 中CD2AP、AKT、nephrin、PI3K mRNA 表 達(dá) 增 多（P＜0.05），BadmRNA 表達(dá)明顯減少（P＜0.01）（表4，表5，圖6）。

表4 糖腎平對STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎組織CD2AP、nephrin mRNA表達(dá)的影響（±s，n = 3）

表4 糖腎平對STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎組織CD2AP、nephrin mRNA表達(dá)的影響（±s，n = 3）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

nephrin 1.24±0.035**0.75±0.045 0.89±0.030*0.79±0.067 1.168±0.011**28.1組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F CD2AP 0.70±0.017**0.55±0.028 0.65±0.005**0.61±0.026*0.65±0.011**8.7

表5 糖腎平對DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、BadmRNA表達(dá)的影響（±s，n = 3）

表5 糖腎平對DKD大鼠腎組織AKT、PI3K、BadmRNA表達(dá)的影響（±s，n = 3）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

Bad 0.83±0.024**1.10±0.045 0.93±0.025**0.93±0.021**0.87±0.028**12.2組別正常組模型組厄貝沙坦組糖腎平小劑量組糖腎平大劑量組F AKT 0.76±0.038**0.49±0.050 0.65±0.060*0.62±0.024*0.70±0.039**5.59 PI3K 1.22±0.124**0.73±0.031 0.99±0.026*0.89±0.081 0.90±0.093 5.14

圖6 大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、AKT、PI3K、Bad mRNA電泳圖

4 討論

在我國經(jīng)濟(jì)迅猛發(fā)展、人口老齡化的社會趨勢影響下，DM 的發(fā)病率年年攀升。目前，我國成年人中DM 患者約占7%，總?cè)藬?shù)高達(dá)0.92 億[10]。DN 是DM 最為常見的并發(fā)癥，它是嚴(yán)重威脅人類健康慢性疾病之一，往往最終進(jìn)展為回天乏術(shù)的終末期腎病[11]。DN 最為主要的病理改變是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，而足細(xì)胞（podocyte）主要有維持腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)和功能正常的作用，在DN的發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用，當(dāng)足細(xì)胞受到高糖和炎癥等的刺激，便會發(fā)生形態(tài)的改變，甚至發(fā)生凋亡脫落，從而對腎小球的正常功能造成不可挽救的損害。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與足細(xì)胞生長、分化、凋亡的調(diào)控[12]，研究表明，足細(xì)胞裂孔蛋白CD2AP和nephrin復(fù)合體可以與PI3K-P85亞基結(jié)合，參與并激活PI3K/AKT 依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控足細(xì)胞的凋亡[13,14]。

糖尿病腎病歸屬于中醫(yī)“水腫”、“尿濁”、“關(guān)格”、“腰痛”、“腎消”和“消渴腎病”范疇。DN 的基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，以氣陰兩虛、精氣虧耗、陰陽兩虛為本虛，以燥熱內(nèi)生、水濕潴留、濕濁瘀毒為標(biāo)實(shí)，病位在腎可累及肝、脾。DM 日久不愈，耗損機(jī)體氣血津液，“久病多虛”可見DN的發(fā)病是以虛為本[15]。DN久病不愈，外熱、郁、痰濕、瘀血、毒邪相互膠結(jié)于腎臟，導(dǎo)致腎臟的正常生理功能損失，大量的有害物質(zhì)聚集在腎組織內(nèi)，長此以往，腎臟廢萎不用，即發(fā)為“腎萎”。腎萎不用，導(dǎo)致水濕、濕濁、瘀毒內(nèi)阻，阻礙腎臟氣血運(yùn)行，日久更甚，失去固攝精微的能力，因此出現(xiàn)蛋白尿。DN 不同時期的病理是不同的，早期正氣不足，邪氣稽留，瘀血阻滯，邪氣與濁毒凝集，形成癥瘕積聚腎內(nèi)，從而可見腎臟體積增大；中晚期，癥瘕日久，瘀血濁毒不斷損傷腎臟的正常生理結(jié)構(gòu)，從而發(fā)生腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，最終可發(fā)為終末期腎病。糖腎平是在“腎萎”假說指導(dǎo)下，按照君臣佐使組方的復(fù)方。方中君藥黃芪能夠利尿消腫、補(bǔ)中益氣、固攝精微；臣藥熟地黃和山萸肉能夠補(bǔ)肝滋腎和益氣生津；佐藥丹皮和地骨皮共奏活血化瘀和清退蓄熱，使藥水蛭起破血消癥之功。全方以滋補(bǔ)肝腎、益氣固精為主，以活血化瘀通腎絡(luò)為輔，其特色為補(bǔ)而不滯，祛瘀而不傷正。祛瘀毒的同時不傷正氣，瘀去濁降除宿根，使氣陰充養(yǎng)，助脾氣、腎精的化生，適宜于治療DN之氣陰兩傷、瘀血阻絡(luò)、精微下泄等癥。糖腎平在多年臨床和實(shí)驗(yàn)上都展現(xiàn)出了對DN 的顯著療效[16,17]，大量組織細(xì)胞分子生物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，糖腎平能夠顯著降低DN 大鼠24 h尿蛋白量，改善DN 大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，緩解DN 大鼠腎臟的病理改變，抵抗足細(xì)胞的損傷和凋亡[9]。

PI3K/AKT 信號通路是參與調(diào)控細(xì)胞生長和凋亡的關(guān)鍵通路之一，而磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）為該通路的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性，PI3K 被激活后會轉(zhuǎn)變成第二信使PIP3，PIP3 接著又會把AKT[18]活化為p-AKT，而p-AKT 又可以通過阻斷凋亡分子Bad 與Bcl-2/Bcl-xL 的結(jié)合從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL檢測到糖腎平可降低腎小球中細(xì)胞凋亡率，維持足細(xì)胞正常生理；免疫組化和RT-PCR結(jié)果同時表明，糖腎平能明顯增加大鼠腎組織中CD2AP、nephrin、PI3K、AKT 的蛋白和mRNA 表達(dá)，降低Bad 蛋白和mRNA 表達(dá)。除此之外，本課題組還應(yīng)用Western blot方法測定了離體培養(yǎng)的足細(xì)胞的相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)糖腎平可以維持足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白穩(wěn)定蛋表達(dá)，保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障，同時進(jìn)一步激活PI3K/AKT 信號通路，抑制足細(xì)胞凋亡，相關(guān)結(jié)果已發(fā)表[20]。

綜上，糖腎平可能通過保護(hù)足細(xì)胞胞裂孔蛋白，維持足細(xì)胞正常的形態(tài)和功能，進(jìn)而保持完整的腎小球?yàn)V過屏障，減輕蛋白尿的癥狀，并進(jìn)一步激活PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制了足細(xì)胞凋亡，減輕腎臟損傷、減輕腎纖維化。