林 艷，李亞梅，吳 萍，夏伯候，林麗美，廖端芳

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根，生首烏能解毒消癰，潤腸通便，截瘧；制首烏能補(bǔ)肝腎，益精血，烏須發(fā)，化濁降脂[1]。何首烏已在中醫(yī)藥防治、食品保健、洗護(hù)用品等方面廣泛應(yīng)用，在我國的年消費量達(dá)到6000噸。隨著何首烏的廣泛使用，何首烏致肝損傷的報道日益增多。本文將就何首烏肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)、毒性機(jī)制及調(diào)控策略進(jìn)行綜述，為何首烏的生產(chǎn)開發(fā)和臨床安全利用提供依據(jù)。

1 何首烏肝毒性

近年來，何首烏引起的肝損傷的發(fā)生率越來越高，其肝毒性引起了廣泛的關(guān)注。有研究統(tǒng)計了450例服用何首烏原藥材、炮制品或制劑等致肝毒性的患者，肝功能損害癥狀出現(xiàn)時間為1-240 d，住院治療的平均時間為6-120d。其中221 例肝損傷類型清楚，肝細(xì)胞型132 例（132/221，59.7%），膽汁淤積型34 例（34/221，15.4%），混合型55 例（55/221，24.9%）。主要臨床癥狀包括黃疸、疲勞、厭食、黃褐色尿、等，其中2 例接受肝移植，7 例死亡，441 例停藥保守治療恢復(fù)或肝功能改善[2]。楊倩等[3]研究劑量與不良反應(yīng)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)何首烏在常規(guī)劑量和超劑量都可能導(dǎo)致肝毒性。何首烏引起的肝毒性具有發(fā)病時間不一、肝損傷類型多樣、毒性劑量不一等特點。

2 何首烏肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)

何首烏肝毒性的化學(xué)成分一直存在爭議，主要有“蒽醌致毒說”、“鞣質(zhì)致毒說”、“二苯乙烯苷致毒說”和“外源性污染物致毒說”[4-7]。

2.1 蒽醌類

“蒽醌致毒說”認(rèn)為蒽醌類成分是導(dǎo)致其肝毒性的“元兇”，蒽醌類中的大黃素低劑量對肝細(xì)胞有促進(jìn)生長的作用，但高劑量抑制肝細(xì)胞生長；大黃酚能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，高濃度的大黃酸能夠損傷肝細(xì)胞[8-9]。汪祺等[10]發(fā)現(xiàn)大黃素能抑制人UDP 葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1 家族多肽A1（UGT1A1）酶的活性，提示大黃素可能為何首烏潛在的肝毒性成分。汪美汐等[11]用肝細(xì)胞L02 考察不同濃度大黃素的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)大黃素的劑量越大，其肝細(xì)胞損傷程度越大，其劑量和毒性成一定的線性關(guān)系。Bounda 等[12]研究發(fā)現(xiàn)大黃酸使人正常肝細(xì)胞HL-7702 凋亡，且大黃酸的劑量和毒性呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。

2.2 鞣質(zhì)

“鞣質(zhì)致毒學(xué)說”認(rèn)為鞣質(zhì)是何首烏的肝毒性化學(xué)成分。大劑量的鞣質(zhì)和二苯乙烯苷配伍可致肝損傷，主要表現(xiàn)為大鼠血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平升高[13]。吳宇等[14]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)何首烏中沒食子酸可能是何首烏肝損傷的化學(xué)成分。Lin 等[15]發(fā)現(xiàn)何首烏的肝毒性主要與沒食子?；痛簏S素-O-己糖硫酸鹽有關(guān)。

2.3 二苯乙烯苷

“二苯乙烯苷致毒說”認(rèn)為二苯乙烯苷是何首烏肝毒性的化學(xué)成分。胡錫琴等[16]發(fā)現(xiàn)何首烏中二苯乙烯苷大劑量長期給藥，大鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量升高，說明大劑量的二苯乙烯苷會對大鼠肝臟造成損傷。采用UPLC/TOF-MS 技術(shù)分析生/制首烏中化學(xué)成分變化，并通過高內(nèi)涵篩選技術(shù)分析生/制首烏的肝毒性，其結(jié)果表明二苯乙烯苷含量減少可能是肝毒性減少的因素之一[17]?；谝旱沃丿B法構(gòu)建類器官3D 培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)順式二苯乙烯苷的肝毒性大于反式二苯乙烯苷的肝毒性[18]。何首烏順式二苯乙烯苷可能通過抑制PPAR-gamm 而致特異質(zhì)肝毒性[19]，順式和反式二苯乙烯苷能免疫協(xié)同產(chǎn)生特異質(zhì)肝毒性[20]。Xu等[21]發(fā)現(xiàn)何首烏中二苯乙烯苷通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450酶系的表達(dá)，從而使乙酰氨基酚肝細(xì)胞損傷加劇。

作者課題組基于粗糙集理論構(gòu)建“譜毒”關(guān)系研究了何首烏特異質(zhì)肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)果顯示二苯乙烯苷是何首烏中毒性最大的化學(xué)成分[22]。體外特異質(zhì)肝毒性實驗結(jié)果也表明二苯乙烯苷是何首烏特異質(zhì)肝毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。對何首烏醇提物的不同極性部位特異質(zhì)肝毒性考察，發(fā)現(xiàn)何首烏50%乙醇洗脫部位的肝毒性最強(qiáng)，而50%乙醇洗脫部位含量最多的為二苯乙烯苷。在對二苯乙烯苷肝毒性的確認(rèn)，其結(jié)果也表明二苯乙烯苷在免疫應(yīng)激條件下可誘導(dǎo)肝毒性[23]（圖1，具體實驗步驟參照文獻(xiàn)22-23）。

圖1 何首烏中二苯乙烯苷（TSG）的特異質(zhì)肝毒性

2.4 外源性污染物

李春等[24]通過測定何首烏中多種真菌毒素的含量，其中一批黃曲霉毒素超標(biāo)，霉變何首烏中檢查出多種真菌毒素，推測何首烏霉變產(chǎn)生的真菌毒素是其導(dǎo)致肝損傷的重要原因之一。少量何首烏在炮制過程中采用了硫熏，殘留的硫可能是導(dǎo)致何首烏肝毒性的原因之一。

3 何首烏肝毒性機(jī)制

2014年6月美國胃腸病學(xué)會將藥源性肝損傷分為固有型藥源性肝毒性和特異質(zhì)型藥源性肝毒性，前者主要是由藥物自身或其代謝產(chǎn)物的直接作用導(dǎo)致，后者主要受機(jī)體因素影響，是藥物和特定機(jī)體狀態(tài)綜合作用的結(jié)果[25]。目前特異質(zhì)型藥源性肝損傷主要是與機(jī)體的免疫炎癥狀態(tài)相關(guān)，分為天然免疫介導(dǎo)的和獲得性免疫介導(dǎo)的特異質(zhì)藥源性肝損傷[26]。

通過圓的引入，幫助學(xué)生創(chuàng)設(shè)了探究情境，學(xué)生在教師的引導(dǎo)之下，進(jìn)行獨立思考和合作探究，從而對橢圓的相關(guān)基礎(chǔ)概念有了一定的認(rèn)識.激發(fā)學(xué)生興趣的同時提升了學(xué)生自主探究的信心.

3.1 何首烏固有型藥源性肝毒性

3.1.1 影響膽汁代謝功能

何首烏致肝損傷的病例部分有黃疸和膽汁淤積的臨床表現(xiàn)，表明何首烏肝損傷可能與機(jī)體的膽汁代謝有關(guān)。王濤等[27]研究了何首烏水提物肝損傷作用，結(jié)果表明何首烏水提物可影響大鼠肝臟膽汁酸的合成、代謝、轉(zhuǎn)運和排泄的相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而引起肝損傷。Wei 等[28]研究何首烏提取物對小鼠肝損傷的作用，其結(jié)果表明何首烏提取物能加快小鼠體內(nèi)膽汁酸的肝腸循環(huán)，引起膽汁酸代謝的變化，其肝損傷作用機(jī)制可能與腸內(nèi)Fxr-Fgf15 信號的激活，肝臟中的Cyp7a1酶表達(dá)的抑制有關(guān)。

3.1.2 損傷肝細(xì)胞線粒體

在正常情況下，細(xì)胞色素P450酶參與外源性藥物代謝產(chǎn)生的親電子基、自由基等活性代謝產(chǎn)物可與谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶結(jié)合排出體外，不會產(chǎn)生毒性。但在外源性毒性成分過量蓄積時，產(chǎn)生過量的親電子基、自由基等活性代謝產(chǎn)物會使肝內(nèi)谷胱甘肽(GSH)耗竭，肝線粒體損傷從而導(dǎo)致肝損傷。歐莉等[29］研究何首烏灌服腎陽虛模型下大鼠的含藥血清對肝細(xì)胞L02的肝毒性，結(jié)果顯示何首烏可致藥源性肝損傷，其機(jī)制可能與肝細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)含量下降所致線粒體損傷有關(guān)。白楊等[30]通過何首烏致大鼠肝損傷的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)制首烏可對腎陽虛模型下的大鼠產(chǎn)生肝損傷，其機(jī)制可能與炎癥因子增加,肝線粒體中Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶的水平下降所致線粒體功能障礙有關(guān)。

3.2 何首烏特異質(zhì)型藥源性肝毒性

3.2.1 代謝酶缺陷致特異質(zhì)肝毒性

遺傳性肝臟代謝酶缺陷可能表現(xiàn)為Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的基因表達(dá)異常，其在藥物性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[31]。李娜等[32]采用藥物代謝酶抑制法觀察代謝因素與何首烏中主要成分反式二苯乙烯苷對小鼠肝臟的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)何首烏對Ⅱ相代謝酶抑制小鼠有明顯的肝損傷作用，說明何首烏對Ⅱ相代謝酶基因多態(tài)性差異或功能低下的患者可能有潛在的肝損傷風(fēng)險。

3.2.2 基于免疫炎癥的特異質(zhì)肝毒性

賀蘭芝等[34]基于脂多糖（LPS）特異質(zhì)炎癥模型，研究何首烏醇提物的肝毒性，發(fā)現(xiàn)何首烏醇提物致大鼠肝毒性的機(jī)制可能與大鼠體內(nèi)的炎癥因子過表達(dá)和PPAR-γ通路異常抑制有關(guān)。井瀟等[35]基于LPS 特異質(zhì)炎癥模型，發(fā)現(xiàn)何首烏醇提物能對大鼠肝細(xì)胞造成損傷，會引起膽汁代謝紊亂、膽汁淤積。謝麗華[36]認(rèn)為LPS 誘導(dǎo)后灌胃大鼠何首烏醇提液，發(fā)現(xiàn)大鼠肝細(xì)胞變性，局部慢性炎性灶的肝損傷，其毒性機(jī)制可能與CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1 的活性和CYP1A2 蛋白表達(dá)抑制有關(guān)。樊星等[37]認(rèn)為在LPS 誘導(dǎo)何首烏肝損傷模型中，血清microRNA-122 可作為靈敏性及穩(wěn)定性好的生物標(biāo)志物。李春雨等[38]從何首烏肝損傷臨床樣本發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子表達(dá)顯著上調(diào)，提示免疫因素參與肝損傷；進(jìn)一步研究LPS 刺激后誘導(dǎo)的何首烏特異質(zhì)肝損傷，發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可能是何首烏致特異質(zhì)肝毒性物質(zhì)，其中順式二苯乙烯苷的毒性大于反式二苯乙烯苷，反式二苯乙烯苷能增強(qiáng)順式二苯乙烯苷的特異質(zhì)肝毒性。

3.2.3 易感人群的特異質(zhì)肝毒性

柏兆方等[39]提出了易感人群（機(jī)體的免疫炎癥活性異常）、免疫增強(qiáng)物質(zhì)（如：反式二苯乙烯苷等）、易感物質(zhì)（如：順式二苯乙烯苷等）這三個因素所誘發(fā)的免疫特異質(zhì)型肝損傷，即特異質(zhì)肝損傷“三因制毒”機(jī)制假說。何首烏的特異質(zhì)肝毒性是基于易感人群的免疫活性異常、炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的。

3.2.4 基于人類白細(xì)胞抗原(HLA)基因多態(tài)性的特異質(zhì)肝毒性

最近，歐陽冬生課題組對何首烏所致肝毒性的臨床病例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)延遲的藥物不良反應(yīng)是由T 細(xì)胞的不適當(dāng)激活引起的，6 號染色體MHC 區(qū)編碼HLA分子是引起T 細(xì)胞不當(dāng)激活關(guān)鍵蛋白，HLA-B*35:01等位基因是何首烏致藥物性肝損傷的遺傳危險因子,可作為預(yù)測何首烏致藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物[40]。

3.3 何首烏肝毒性原理的困惑與二苯乙烯苷分解代謝障礙致毒原理的思考

3.3.1 直接肝毒性學(xué)說依據(jù)與困惑

直接肝毒性學(xué)說主要依據(jù)有：1）存在直接毒性成分；2）與劑量相關(guān)；3）與用藥時間相關(guān)，潛伏期較長，肝功能損害的癥狀大多發(fā)生在服藥后一個月左右，說明需要一定時間的累積；4）可用動物模型模擬。直接肝毒性符合一般藥源性肝毒性的基本特征，但又不遵循一般藥源性肝毒性的普遍規(guī)律，即有很大的人群差異。

3.3.2 免疫激活（“三因致毒”、或特異質(zhì)肝毒性）學(xué)說的依據(jù)與困惑

前面提到的免疫炎癥的特異質(zhì)肝毒性、易感人群的特異質(zhì)肝毒性、基因多態(tài)性的特異質(zhì)肝毒性可以歸納為免疫激活肝毒性學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為何首烏對正常人群基本無毒，只有特異質(zhì)免疫異常人群才呈現(xiàn)毒性。反式二苯乙烯苷（trans-SG）主要激活免疫狀態(tài)，順式二苯乙烯苷（cis-SG）具有潛在毒性，二者結(jié)合加上免疫異常人群，誘發(fā)肝毒性。免疫激活學(xué)說的依據(jù)：1）有效成分與毒性成分重疊，固有毒性小。實際使用何首烏的二苯乙烯苷含量遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的毒性劑量上限；2）病理改變呈現(xiàn)免疫炎癥特征。損傷部位有大量淋巴細(xì)胞浸潤、可見嗜酸性小體，與自身免疫性肝病難以區(qū)分，與對乙酰氨基酚等直接肝損傷不同；3）采用內(nèi)毒素（LPS）免疫敏化的動物模型可重現(xiàn)何首烏特異質(zhì)肝毒性；4）家族性聚集案例，存在再激發(fā)現(xiàn)象。最近發(fā)現(xiàn)何首烏肝毒性與人群HLA 基因多態(tài)性有關(guān)，是免疫激活學(xué)說的最新證據(jù)。但免疫激活學(xué)說不能完全解釋何首烏的肝毒性臨床表現(xiàn)，也不完全遵循特異質(zhì)肝毒性的普遍規(guī)律，即與用藥劑量及時間關(guān)系不大。并且，trans-SG 是何首烏中該類化合物的主要成分，也是體內(nèi)主要存在形式，存在直接肝毒性。

3.3.3 轉(zhuǎn)化代謝學(xué)說的依據(jù)與困惑

轉(zhuǎn)化代謝學(xué)說的依據(jù)：1)二苯乙烯苷主要經(jīng)II 相肝藥酶代謝，生成trans-SG 的葡糖醛酸結(jié)合物，然后隨膽汁經(jīng)由腸道排出，部分以二苯乙烯苷重吸收。2）代謝酶抑制劑酮康唑顯著增加trans-SG 的肝損傷程度。而在人重組UGT 同工酶II 相代謝孵育體系中，檢測到trans-SG 的葡糖醛酸代謝物，其毒性也降低。但是，在穩(wěn)定持續(xù)給藥條件下，由于trans-SG 重吸收會導(dǎo)致其體內(nèi)濃度不斷增加。即意味著，只要長時間使用何首烏，所有人群都可能存在肝毒性風(fēng)險，這與何首烏肝毒性的臨床表現(xiàn)也不完全符合。

3.3.4 二苯乙烯苷分解代謝障礙致毒原理的思考

根據(jù)物質(zhì)體內(nèi)代謝的一般規(guī)律，二苯乙烯苷在體內(nèi)還可以繼續(xù)進(jìn)行分解代謝。只要體內(nèi)對trans-SG進(jìn)行分解代謝的酶正常，trans-SG 的累積性毒性就不會發(fā)生。相反，因遺傳因素或后天影響導(dǎo)致代謝trans-SG 的酶活性降低，必將導(dǎo)致trans-SG 體內(nèi)蓄積，引起肝損傷。經(jīng)文獻(xiàn)研究，發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可經(jīng)兩步進(jìn)行分解代謝：第一步，經(jīng)β-D-葡萄糖苷酶脫苷形成二苯乙烯苷苷元，第二步經(jīng)過氧化物酶（如乳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶）打開雙鍵，生成無毒的對羥基苯甲醛或2,3,5-三羥基苯甲醛（圖2）。因此，我們提出二苯乙烯苷分解代謝障礙致毒原理：即體內(nèi)葡萄糖苷酶或/和過氧化物酶活性低，將導(dǎo)致二苯乙烯苷分解代謝障礙而蓄積，最終引起肝毒性。這可能成為何首烏肝毒性的原理之一。

圖2 二苯乙烯苷轉(zhuǎn)化、分解代謝原理圖

4 何首烏肝毒性的防控策略

4.1 建立何首烏質(zhì)量評價體系

2015 年版《中國藥典》中生首烏和制首烏的主要質(zhì)量控制成分為游離蒽醌、結(jié)合蒽醌和二苯乙烯苷，對三者的最低含量進(jìn)行了規(guī)定，不能完全有效地評價生/制何首烏的質(zhì)量。建立何首烏的指紋圖譜，可為何首烏的質(zhì)量評價提供依據(jù)。作者課題組采用超高效液相色譜，建立不同產(chǎn)地生/制何首烏二苯乙烯苷的含量測定方法和指紋圖譜，可為何首烏藥材整體質(zhì)量控制的提供參考[41]；我們采用高效液相（HPLC）對20 批生/制何首烏進(jìn)行檢測，建立何首烏指紋圖譜，對10 個共有峰中的4個進(jìn)行指定，分別為沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚，并對二苯乙烯苷和大黃素的含量進(jìn)行測定，可為何首烏質(zhì)量整體信息的控制提供依據(jù)[42]。

4.2 采用合理的炮制方法

目前，炮制減毒、配伍減毒、化學(xué)減毒和生物發(fā)酵減毒為何首烏主要的炮制減毒方法。黑豆蒸/燉制、高壓炮制、七蒸七曬炮制等減毒方法所需溫度高且工序復(fù)雜，應(yīng)規(guī)范化其炮制工藝[43]。臨床上何首烏主要與茯苓配伍減毒[44]，龐晶瑤等[45]考察何首烏與茯苓、甘草、三七的配伍減毒情況，發(fā)現(xiàn)茯苓減毒的作用效果最明顯。盧鑾等[46]發(fā)現(xiàn)何首烏與不同劑量的黑豆配伍，能夠緩解何首烏所致的膽汁淤積型肝損傷。楊倩等[3]發(fā)現(xiàn)含何首烏處方藥味數(shù)的增加并沒有導(dǎo)致不良反應(yīng)的增加，提示合理配伍可以減少何首烏毒性。這些結(jié)果都表明合理配伍、組方得當(dāng)可以減少何首烏的肝毒性。中藥生物發(fā)酵減毒技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥炮制領(lǐng)域，其中應(yīng)用最廣的微生物是真菌中的靈芝菌。靈芝菌是多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum）的菌種，為首個全基因組圖譜確切，藥用真菌次生代謝物種[47]。作者課題組發(fā)現(xiàn)靈芝菌能轉(zhuǎn)化何首烏中的二苯乙烯苷，且能定量轉(zhuǎn)化二苯乙烯苷，且轉(zhuǎn)化后其毒性降低。靈芝菌中碳水化合物酶系的β-D-葡萄糖苷酶能水解苷形成相應(yīng)的苷元[48]。靈芝菌中木質(zhì)素修飾酶系的木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）能羥化苯乙烯結(jié)構(gòu)中的C=C 雙鍵[47,49]。靈芝菌轉(zhuǎn)化減毒的機(jī)制可能為靈芝菌通過β-D-葡萄糖苷酶和木質(zhì)素過氧化物酶斷裂何首烏中二苯乙烯苷的糖苷鍵和C=C 雙鍵形成無毒化學(xué)成分而減毒，為中藥的炮制減毒提供實驗依據(jù)。

4.3 辨證論治，個體化用藥

生首烏臨床可用于腸燥便秘、風(fēng)疹瘙癢、瘡瘍等，制何首烏可用于治療脫發(fā)、白發(fā)等屬肝腎陰虛或精血虧虛患者，臨床使用時應(yīng)辨證、對證用藥[50-51]。腎陽虛證(線粒體能量代謝水平偏低)者如在臨床誤用何首烏，會使其線粒體能量的代謝水平進(jìn)一步降低，肝毒性化學(xué)成分代謝障礙而致毒。何首烏臨床使用時，應(yīng)關(guān)注特殊人群(兒童、老人、肝功能不全等)用藥安全；在易感人群服用何首烏時，應(yīng)進(jìn)行人群易感性篩查，隨時對肝功能進(jìn)行監(jiān)測，確保其安全性。

5 小結(jié)

隨著何首烏及其成方制劑在預(yù)防和治療疾病中的廣泛使用，其肝毒性引起了人們的廣泛關(guān)注。何首烏肝毒性化學(xué)成分及致毒原理尚未完全闡明。本文通過分析現(xiàn)有文獻(xiàn)資料及結(jié)合作者課題組的工作，認(rèn)為二苯乙烯苷既是何首烏的有效成分，也是導(dǎo)致肝毒性的主要成分之一。何首烏導(dǎo)致肝毒性的機(jī)理應(yīng)是多方面的，包括直接肝毒性、免疫激活肝毒性（特異質(zhì)免疫損傷和基因多態(tài)性免疫應(yīng)激）和代謝障礙肝毒性，其中分解代謝障礙所致肝毒性以往關(guān)注較少，應(yīng)引起重視?？山⒑侠碣|(zhì)量評價體系、優(yōu)化炮制工藝和實施辨證論治、個體化用藥等進(jìn)行綜合防控。