李洪亮，劉 明，汪選斌＊＊

（1. 湖北醫(yī)藥學院 附屬人民醫(yī)院腫瘤中心中藥藥理實驗室 441000；2. 生物醫(yī)藥研究院 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室 湖北 十堰 442000；3. 西安交通大學藥學院 西安 710061）

惡性腫瘤是世界性難治性慢性病[1]。具有死亡率高、復發(fā)率高、易轉(zhuǎn)移等特點，目前的手術切除、化療、放療，乃至免疫療法等仍無法使其徹底治愈。從中藥藥理學規(guī)范研究的角度，針對腫瘤生物學特征（hallmark）靶點的研究可以較好地總結、歸納抗腫瘤的藥理機制[2]。脂代謝異常是hallmark 其中之一。由于腫瘤細胞快速增殖，為保證能量供應，在腫瘤組織中對脂質(zhì)合成、去飽和化和轉(zhuǎn)運會增加[3]，并通過相關的通路對腫瘤的增殖和死亡[4]、血管生成、侵襲、遷移造成影響[5]。近年來中藥抗腫瘤脂代謝受到關注。

蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）是常見的補益類中藥[6]，也是道教醫(yī)藥中常用的補益方藥[7]，東漢時期被稱為馬肝石，以干燥塊根入藥。唐朝李翱在《何首烏傳》中記載了有位叫何首烏的人，祖上信奉道教，“生而閹弱，年五十八，無妻子，常慕道術，隨師在山”，偶然得藥用之，不僅所有疾病皆無，頭發(fā)還變黑，祖孫壽命皆過百，后人便以其孫之名把這種藤能“夜交”的藥稱為何首烏[8]?！吨袊幍洹分杏涊d何首烏（Polygoni Multiflori Radix）有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便之功效，制首烏（Polygoni Multiflori Radix Praeparata.）可補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂[9]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)何首烏、制首烏主要藥理作用近似，可用于神經(jīng)保護、抗衰老、心肌保護、降血脂及抗動脈粥樣硬化、保肝致瀉、抗菌、促進造血功能，以及具有抗腫瘤作用[10]。臨床組方可用于肝癌、腦瘤、甲狀腺癌、白血病[6,11]。本文試結合本課題組近年來建立的基于腫瘤生物學特征的抗腫瘤中藥藥理學篩選技術平臺，對何首烏抗腫瘤脂代謝進行回顧，為進一步開發(fā)何首烏的抗癌活性和臨床應用提供參考。

1 基于腫瘤生物學特征的抗腫瘤中藥藥理學篩選技術平臺建設與何首烏抗腫瘤細胞能量代謝失衡

腫瘤發(fā)病機制差異很大，即使同一器官的腫瘤，如肺癌中有小細胞肺癌和非小細胞肺癌，后者又包括鱗癌、腺癌、大細胞癌[12-13]；乳腺癌按分子分型，可分為：Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2+型和Basal-like型[14]。其診治完全各異。提示針對其特定的分子靶點開展研究，是中藥藥理學規(guī)范研究要點。因此，基于Hanahan在Cell上腫瘤生物學特征的經(jīng)典分類[15]，我們將中藥抗腫瘤學藥理學研究根據(jù)分子靶點機制分為了11 類，并逐步建立相應的規(guī)范研究技術平臺[2,16-21]。我們總結發(fā)現(xiàn)，何首烏可抑制腫瘤細胞增殖、組滯細胞周期、誘導凋亡、抗腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、抗血管新生[22]、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤干細胞[6,23]。但這些作用是否之間存在相互作用或干擾（cross-talk）尚不清楚。

腫瘤的細胞能量代謝失衡（deregulating cellular energetics）是腫瘤生物學特征之一，包括糖代謝異常和脂肪代謝異常[15]。腫瘤細胞的糖代謝異常主要是對糖的攝取[24]和有氧糖酵解（Warburg 效應）[25]。有文獻報道何首烏中有效成分二苯乙烯苷對肝臟糖代謝有影響，可減輕糖尿病模型大鼠和小鼠腎損傷（包括對30 mmol/L 高糖環(huán)境足細胞的氧化損傷）[26-28]，改善胃腸動力[29]，目前沒有二苯乙烯苷對腫瘤細胞糖代謝的影響報道。另一方面，我們總結發(fā)現(xiàn)，何首烏能夠減輕非酒精性脂肪肝、抗肝氧化、肝纖維化、肝硬化和肝癌，可用于高脂血癥[30]。并且大黃素、大黃酚（何首烏中含有的蒽醌類成分）對腫瘤脂代謝可能有作用[31-32]，但機制尚不清楚，這些引起了我們的興趣。

2 何首烏抗腫瘤脂代謝的機制

腫瘤的新生脂肪（de novo lipogenesis）與肝癌脂代謝中的重要轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）關系密切，SREBP1 在多種腫瘤中高表達，并通過影響下游的脂肪酸代謝相關因子參與了腫瘤的脂肪代謝。如通過乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACACA）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN）、ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACLY）等，促進脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）與甘油三酯（tryglyceride，TG）的合成；通過促進硬脂酰CoA 去飽和酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD1）的轉(zhuǎn)錄，使脂肪酸去飽和化；通過影響下游脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（fatty acid-binding protein3/7，F(xiàn)ABP3/7），影響FA 的轉(zhuǎn)運[33]。何首烏是否干預了腫瘤的脂代謝，是否與上述途徑有關是我們需要研究的方向。由于制何首烏具有補肝腎之功效，結合前期工作，我們選用制何首烏醇提物作用于肝癌細胞來研究其抗癌活性。通過研究發(fā)現(xiàn)，制何首烏醇提物可抑制肝癌細胞的增殖，并使肝癌細胞線粒體膜電位下降，從而誘導了肝癌細胞內(nèi)源性凋亡。進一步又發(fā)現(xiàn)制何首烏醇提物干擾了肝癌細胞的FA 去飽和化，使肝癌細胞的不飽和酸亞油酸和棕櫚油酸與其對應的飽和脂肪酸硬脂酸和棕櫚酸比例下調(diào)，提示制何首烏醇提物干擾肝癌細胞FA 的去飽和化與其誘導細胞凋亡可能有關；FA的去飽和化依賴于SCD1的活性，其上游正是SREBP1。于是我們有檢測了制何首烏醇提物對肝癌細胞SREBP1 和SCD1 的影響，發(fā)現(xiàn)二者RNA 和蛋白表達水平均下降，與我們的推測一致，即：SREBP1 可介導下游多種脂代謝信號的轉(zhuǎn)錄，其中包括SCD1[34]，SCD1 是一種錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的酶，可催化飽和FA 如硬脂酸、棕櫚酸去飽和化變成不飽和的亞油酸和棕櫚油酸，亞油酸和棕櫚油酸則在長鏈脂肪酸延長酶（long-chain fatty-acyl elongase，ELOVL）的作用下，轉(zhuǎn)化為其它不飽和酸而為細胞存活提供支持[35-36]。而硬脂酸、棕櫚酸去飽和化受阻可能導致FA 堆積和不平衡[35,37-38]，誘導內(nèi)源性細胞凋亡。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)制何首烏醇提物通過抑制SREBP1的轉(zhuǎn)錄活性而降低肝癌細胞的脂代謝，誘導了細胞內(nèi)源性凋亡[39]。但制何首烏醇提物中何種成分發(fā)揮了作用，不得而知。

3 何首烏抗腫瘤脂代謝的物質(zhì)基礎

我們在前期文獻復習中，發(fā)現(xiàn)何首烏主要的抗癌活性成分包括二苯乙烯類成分如二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG）和白藜蘆醇（resveratrol）；蒽醌類成分如大黃素（1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone，emodin），蘆薈大黃素（aloe-emodin），大黃酚（chrysophanol），大黃素甲醚（physcion），大黃酸（rhein），大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（emodin-8-O-β-D-glucoside），大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（physcion-8-O-β-D- glucoside），鞣質(zhì)類（tannins）等[6,11]。TSG 在何首烏中含量很高，但其抗腫瘤作用報道不多，顧民華等[40]報道它能增加肝癌細胞對順鉑的敏感性，我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，TSG對腫瘤細胞增殖抑制濃度大于1 000 μM（數(shù)據(jù)未發(fā)表）時單獨抗腫瘤作用研究價值不大。而大黃素等蒽醌類化合物抗癌活性報道較多[30]，文獻報道何首烏中有蒽醌類成分22 種[41-42]。我們選取了6 種常見的化合物：大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚，進行抗腫瘤脂代謝的篩選。以MTT 法檢測了6 種蒽醌類化合物對肝癌細胞Bel-7402 的增殖，并檢測了對SREBP1 的mRNA 和蛋白的表達影響，結果發(fā)現(xiàn)這6 種蒽醌類成分對肝癌細胞的抑制作用順序大小依次為：大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚。其中IC50值小于400 μM 的有大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚；對SREBP1 的mRNA 和蛋白表達有抑制作用的是大黃素、大黃酸和大黃素甲醚[43]。大黃酚對肝癌細胞SREBP1 無抑制作用，這與Li 等人報道的大黃酚可通過抑制SREBPs 表達抑制肝癌細胞Huh-7 脂代謝的結果不一致[32]，這可能是因為細胞系的不同以及實驗室間差異。由于大黃素在何首烏蒽醌類成分中含量最高[44]，且Lee 等人報道它對腫瘤細胞的FA 合成有抑制作用[31]，因此，我們選用大黃素為代表，研究何首烏抗腫瘤脂代謝的主要活性及其作用機制。

大黃素，除何首烏外，還存在于其它蓼科植物如大黃、虎杖和豆科決明子等植物中[16]。它能抑制腫瘤細胞周期因子D（Cyclin D）和細胞周期因子E（Cyclin E）[45]，周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）[46]；通過激活胞外凋亡因子fas 配體（Fas ligand，F(xiàn)ASL）[47]、細胞色素C（cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-9）和凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）[48]，降低細胞膜電位（membrance potential）[49]而誘導細胞凋亡[50]；通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以 及Wnt/β-Catenin 通路抑制遷移和侵襲；通過抑制多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance-associated protein 1，MRP-1）而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥[51]；通過抑制FA 合成而抑制腫瘤脂代謝[31]。此外，大黃素還可以同時誘導腫瘤細胞內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡[52]。因此，我們首先檢測了大黃素對肝癌細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)它能夠降低細胞的膜電位，誘導Caspase 依賴的和非依賴的內(nèi)源性細胞凋亡。通過檢測TG和總膽固醇（total cholesterol，TC），以及亞油酸/硬脂酸、棕櫚油酸/棕櫚酸的比例，發(fā)現(xiàn)大黃素可以使TG、TC 合成減少，并減少了硬脂酸和棕櫚酸的去飽和化，同時qPCR 和蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)大黃素使肝癌細胞的脂肪酸合成酶ACLY、ACACA、FASN以及SCD1表達減少，同時SREBP1也受到抑制。此結果與上述制何首烏醇提物對肝癌細胞的抑制機制近似，提示制何首烏醇提物中主要降脂抗癌活性物質(zhì)有大黃素。為進一步驗證SREBP1在大黃素抗腫瘤脂代謝中的作用，我們又建立了SREBP1 過表達（SREBP1-OE）和敲除（SREBP1-KO）細胞株，與大黃素作用進行對照，發(fā)現(xiàn)有趣的是，大黃素對腫瘤細胞的凋亡作用和對脂代謝的抑制作用雖然與SREBP1敲除的結果類似，但大黃素的凋亡誘導作用強度遠遠大于SREBP1敲除的結果。提示大黃素是通過SREBP1依賴和非依賴的途徑誘導了內(nèi)源性凋亡[53]。結合Lee 等人有關大黃素可抑制FASN 的報道[31]，我們推測大黃素可能同時激活了內(nèi)源性和外源性凋亡途徑，其中內(nèi)源性凋亡途徑與抑制脂代謝有關。此外，制何首烏醇提物及大黃素不僅僅通過抑制SREBP1 而誘導凋亡，或者換言之，單純敲除SREBP1并不能使腫瘤細胞過度凋亡，提示腫瘤細胞的脂代謝只是能量代謝、生存的一種途徑而不是主要途徑[54-56]。這一結果從腫瘤的耐藥和難治性考慮有一定的意義。一方面，單純抑制腫瘤的SREBP1 途徑只能控制細胞增殖而不能完全殺滅腫瘤細胞，可能導致耐藥；另一方面，目前有些化療病人無法耐受甚至死于化療不當[57]，遠不及帶瘤生存、提高病人生存質(zhì)量收益更大。

4 展望與結語

早期研究證實，腫瘤細胞及組織中FA、磷脂（phospholipid）高于正常組織，F(xiàn)A 的合成異常升高，這與脂質(zhì)合成的FASN 調(diào)控密切相關[3]。FASN 抑制劑在HER2/neu 轉(zhuǎn)基因小鼠中被證實有效[58-60]。脂質(zhì)合成其他酶包括ACACA、SCD1[60-62]等，受到抑制后也可影響腫瘤細胞的生長、增殖。作為第二信使的磷酸肌醇（inositol phosphate）、溶血磷脂酸（lysobisphosphatidic acids，LPA）等，通過激活下游信號蛋白增強腫瘤細胞的增殖、遷移和存活[63]。近年來研究還表明作為脂質(zhì)合成的關鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP1異常表達與腫瘤的惡性程度密切相關[64-66]，提示SREBP1是中藥抗腫瘤脂代謝的重要靶點。

腫瘤防治是個復雜的問題，中醫(yī)藥在防治腫瘤上發(fā)揮著一定的作用。以何首烏為例，我們發(fā)現(xiàn)它有抑制腫瘤的脂代謝的作用，機制與抑制SREBP1 通路有關。但同時，它還有SREBP1 非依賴性的誘導凋亡通路。由于何首烏中成分復雜，抗腫瘤活性成分以蒽醌類為主，但蒽醌類成分作用強弱卻不一樣，，提示中藥抗腫瘤存在多成分、多靶點、多途徑。展望下一步工作，一是包括抑制脂代謝在內(nèi)的何首烏抑制腫瘤作用與機制到底如何，需要進一步研究；二是活性成分對脂代謝SREBP1 的作用有強有弱、有的甚至沒有。我們在對6 種常見的化合物大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚，進行抗肝癌Bel-7402 細胞脂代謝的篩選中，發(fā)現(xiàn)48h內(nèi)IC50值小于400 μM 的有大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚。其中小于或等于100 μM 有大黃素和大黃酸[42]。而我們用制何首烏醇提物（對人肝癌Bel-7402 細胞24 h 的IC50值約400 μg/mL）中游離蒽醌類含量（以大黃素和大黃素甲醚計）為0.1%[38]，若全部以大黃素計，制何首烏醇提物中大黃素（分子量270.24）折合成摩爾濃度為：1.48 μM，遠遠小于大黃素的IC50值。但制何首烏醇提物與單純的活性成分大黃素作用強弱相似，是實驗誤差問題，還是成分之間的相互作用?有些成分即使沒有作用，但是否有促進其它成分活性的可能性?是增強作用（potentiation），還是中藥多組分的疊加作用（additive effect of multiple compounds of TCMs）[67]?此外，我們前期總結發(fā)現(xiàn)蒽醌類成分也存在于其它植物如大黃、決明、虎杖等。其含量也不盡相同，其中大黃素在何首烏中含量為0～1.52%，比其它植物相對高[23]，結合何首烏及其活性成分對肝癌脂代謝的影響各異，深入研究何首烏中蒽醌類成分降脂抗癌活性及其成分之間相互作用，有一定意義。

研究抗腫瘤中藥的另一個重要問題就是抗腫瘤中藥技術方法的規(guī)范性問題。具體到何首烏抗腫瘤研究的問題，市售何首烏質(zhì)量不一，生首烏和制首烏由于來源不同、產(chǎn)地不同，采收季節(jié)不同、炮制加工不同其質(zhì)量會有不同[68-69]。因此，研究何首烏首要的工作是質(zhì)量控制。此外，藥理學機制研究需基于某一公認度高的靶點或機制分類方法，并以此建立技術平臺[2]。何首烏的抗腫瘤機制研究正是我們建立了基于腫瘤生物學特征的篩選平臺，從腫瘤的細胞能量代謝失衡入手，發(fā)現(xiàn)了其抑制脂代謝的機制（Fig 1）。

Fig 1 針對腫瘤生物學特征的何首烏抗脂代謝研究思路與技術路線。實線為本課題組研究發(fā)現(xiàn)。虛線為可能存在的其它途徑。