宋禎彥，余婧萍，賀春香，陳易璇，李富周，成紹武

（湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室 長沙 410208）

1 前言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是與衰老相關(guān)的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。根據(jù)阿爾茨海默病協(xié)會2016年發(fā)布的1份報告，每33秒就會出現(xiàn)1 例AD 新病例，每年新增病例近100 萬例，預計到2050 年，該病的流行范圍將達到1100 萬到1600 萬[1]。AD 是由復雜的病因引起神經(jīng)功能障礙，其發(fā)病的分子機制尚不明確[2]。目前大多數(shù)人認為AD 的發(fā)病過程與腦內(nèi)高密度的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)，但目前針對上述發(fā)病環(huán)節(jié)的藥物并不能減緩或阻止AD 的進展[1]。因此，需要進一步研究AD 的發(fā)病機制以制定有效的治療策略。

據(jù)報道大約70%的AD 發(fā)病危險因素是由遺傳引起的，通常涉及多個基因[3]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，基因芯片能同時對數(shù)千個基因的表達進行分析，可有效地用于研究與AD 發(fā)病相關(guān)的基因網(wǎng)絡[4]。不同階段的AD 患者、同一階段AD 患者的不同腦區(qū)，其基因表達譜有很大差異[5,6]。大腦海馬區(qū)主要負責記憶和學習，AD 中海馬是首先受到損傷的區(qū)域，表現(xiàn)癥狀為記憶力衰退以及方向知覺的喪失，經(jīng)缺血缺氧后，海馬CA1 區(qū)發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)元損傷而出現(xiàn)空間定位和學習記憶功能障礙[7]?；虮磉_綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus datasets，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中的基因芯片數(shù)據(jù)GSE28146 包含從早期到晚期AD 的一系列與認知功能障礙和神經(jīng)纖維纏結(jié)癥狀相對應的海馬CA1 區(qū)基因表達的變化[8]。我們據(jù)此來分析AD 不同時期大腦CA1 區(qū)細胞的基因表達變化規(guī)律，期望找到在AD 不同時期共性表達的關(guān)鍵基因，以進一步闡明AD 發(fā)病機制并為尋找新的治療靶點提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 細胞

SH-SY5Y 細胞株購自中國科學院上海生命科學研究所。

2.2 主要試劑

β-淀粉樣蛋白1-42（amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42，A9810）購自上海榮創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；噻唑藍（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT，ST316）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，D806645）購自上海麥克林生化科技有限公司；TRIzol（15596-026）購自美國Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A）購自日本TaKaRa 公司；SYBR 染料（SYBR Premix Ex Taq II，RR820L）購自日本TaKaRa公司。

2.3 主要方法

2.3.1 GEO數(shù)據(jù)挖掘

從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫GEO 中下載編號為GSE28146 的芯片數(shù)據(jù)原始文件，該芯片數(shù)據(jù)來源于早期、中度、重度阿爾茨海默病患者，包含總樣本數(shù)30 例，其中正常8 例，早期7 例，中度8 例，重度7 例。利用激光顯微切割術(shù)獲取石蠟包埋的大腦海馬CA1區(qū)灰質(zhì)組織，基于美國昂飛公司人類基因組U133+2.0 芯片平臺（GPL570: [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）的基因表達譜進行芯片數(shù)據(jù)采集分析。本研究利用Robust Multiarray Average（RMA）算法對芯片數(shù)據(jù)進行了背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，同時采用limma 包對芯片數(shù)據(jù)進行二次分析，并結(jié)合P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進行顯著差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05，F(xiàn)C ＞2。

2.3.2 AD 患者不同時期（早期、中度、重度）差異基因的獲取

使用R 語言分析包以P＜0.05，F(xiàn)C ＞2為篩選條件分別篩選AD 早期患者與正常對照、AD 中度患者與正常對照、AD 重度患者與正常對照的顯著差異基因。合并篩選AD 3 個時期的差異基因，獲取在AD 早期、中度、重度均出現(xiàn)顯著差異的重合基因，利用Venny2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）構(gòu) 建韋恩圖。

2.3.3 蛋白互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction network,PPI network）構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

PPI network 可用于過濾和評估功能基因組數(shù)據(jù)，并對理解功能基因的產(chǎn)物蛋白的相互作用及其影響的主要生物學功能提供一個可視化的平臺[9]。探索預測AD 不同時期共同的DEGs（differentially expressed genes）的PPI 網(wǎng)絡可以為尋找AD 發(fā)生的重要作用靶點以及未來的防治方案提供新的方向。本文利用相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索在線數(shù)據(jù)庫STRING（https://string-db.org/）[10]來尋找AD 不同時期共同的DEGs 的相互作用（score ≥0.4），然后使用Cytoscape-v3.6.1 進行構(gòu)建網(wǎng)絡圖。在此基礎(chǔ)上，對PPI 網(wǎng)絡進行拓撲學特征分析，通過Cytoscape 的插件CytoNCA 計算參數(shù)來評價網(wǎng)絡中每個節(jié)點在功能上的重要性，篩選參數(shù)分別為中間中心性（Betweenness centrality，BC）和接近中心性（Closeness centrality，CC），度中心性（Degree centrality，DC）、特征向量中心性(Eigenvector centrality，EC）、基于局部平均連通性的方法（Local average connectivitybased method，LAC）、網(wǎng)絡中心性（Network centrality，NC），這6 個典型的中心屬性參數(shù)用以進行評價網(wǎng)絡節(jié)點的重要性，值越大說明節(jié)點越接近網(wǎng)絡中心位置，即關(guān)鍵基因[11]。

2.3.4 關(guān)鍵基因的Gene Ontology和pathway富集分析

基因本體論分析（Gene Ontology，GO）（包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF））和KEGG通路富集分析是描述候選基因生物學特征的常用方法[12]。GOBP 是生命活動的重要體現(xiàn)，GOBP 富集分析可以體現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的重要生物學過程[13]。我們利用（DAVID,https://david.nicifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進行功能注釋和富集分析，以P-Value ＜0.5 為參數(shù)獲得關(guān)鍵基因的GOBP富集條目。本研究利用生物信息學在線分析平臺Omicshare（http://www.omicshare.com）以P＜0.5、FDR ＜0.05 為參數(shù)獲取關(guān)鍵基因的pathway 富集信息。

2.3.5 細胞造模及細胞活力檢測

SH-SY5Y 用含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。當細胞生長處于對數(shù)期時，按8×103個/孔的細胞密度轉(zhuǎn)移到96 孔板中，培養(yǎng)12 h 使其貼壁，分別設立正常組、Aβ1-42造模組（1.25，2.5，5，10，20，40 μmol·L-1）。各組細胞培養(yǎng)24h 后加入5 mg·mL-1MTT 溶液10 μL，37℃孵育4 h 后棄上清并加入DMSO 200 μL 每孔，酶標儀上震蕩30 min，490 nm 波長處測定吸光度A，細胞的生存率=（A 實驗組-A 調(diào)零孔）/（A空白組-A調(diào)零孔）×100%，每組均設置3個復孔。

2.3.6 關(guān)鍵基因的表達qPCR驗證

細胞培養(yǎng)方法如1.5，按5 × 105個/孔的細胞密度轉(zhuǎn)移到6孔板中培養(yǎng)12 h使其貼壁，分別設立正常組、Aβ1-42（10 μmol·L-1）造模組，培養(yǎng)24 h 后提取總RNA?？俁NA 提取使用TRIzol, 反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA 使用

TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser。采用SYBR Premix Ex Taq II 和CFX96 熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國），按照試劑盒說明書對篩選出的5個關(guān)鍵基因進行qPCR 驗證。所用引物序列從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取，使用Primer Premier6.0 軟件設計并由華大基因有限公司進行合成（表1）。

表1 引物序列

2.4 統(tǒng)計方法

采用Prism GraphPad 6.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 AD 患者不同時期（早期、中度、重度）差異基因的分析

二次挖掘分析GEO 芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片GSE28146，以P＜0.05，差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）＞2 為篩選分析AD 早期患者與正常對照組的基因差異表達情況，芯片結(jié)果顯示共有2314 差異表達基因；AD中度患者與正常對照組比較共有1782 個基因差異表達；AD 重度患者與正常對照組比較存在929個顯著差異基因。其中，在AD 三個時期均存在差異表達的基因有419 個（如圖1），其中上調(diào)基因有235 個，下調(diào)基因有184個。

3.2 AD差異基因的PPI網(wǎng)絡分析及關(guān)鍵基因篩選

將419 個與AD 相關(guān)性蛋白靶點導入到STRING數(shù)據(jù)庫獲取這些靶點的PPI 網(wǎng)絡（圖2），其中249 個蛋白之間存在498種相互作用關(guān)系。采用CytoNCA 計算PPI 網(wǎng)絡的BC、CC、DC、EC、LAC 和NC 值并進行篩選（圖3），這些參數(shù)中DC 值大于兩倍中位數(shù)值的節(jié)點為重要節(jié)點，所以第一次篩選采用DC 大于兩倍中位數(shù)即DC ＞4 進行篩選，得到初步篩選出的網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡有86 個節(jié)點，285 個邊，在此基礎(chǔ)上以DC ＞8.3489、EC ＞ 0.0675、BC ＞ 172.8372、CC ＞ 0.3414、NC ＞3.8023、LAC ＞2.5763 對網(wǎng)絡進行第二次篩選，得到核心網(wǎng)絡[11,14]。該網(wǎng)絡有12 個節(jié)點存在48 種相互作用關(guān)系，因此該12個核心靶點確定為AD發(fā)生過程中的關(guān)鍵基因（表2）。

圖2 AD相關(guān)的蛋白靶點的PPI網(wǎng)絡圖

圖3 關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡分析.

表2 關(guān)鍵基因的差異表達（AD VS. Control）

圖4 關(guān)鍵基因的富集分析

3.3 關(guān)鍵基因的GO分析和pathway分析

為了進一步了解關(guān)鍵基因的作用，通過GO 和KEGG 通路富集分析來初步揭示它們在AD 發(fā)生過程中起到的生物學作用。結(jié)果表明靶點參與的生物過程為一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細胞凋亡、缺氧反應、細胞間黏著、聚集過程、蛋白質(zhì)乙?；?、MAPK 復合物調(diào)控、細胞因子介導的信號通路調(diào)控以及胰島素受體信號通路調(diào)控（圖4A）等，其中一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細胞凋亡、MAPK復合物調(diào)控等都為AD發(fā)生過程中的關(guān)鍵過程[15]。此外，這些關(guān)鍵基因主要參與了Rap1 信號通路、Ras 信號通路、NF-κB 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Phospholipase D 信號通路、Jak-STAT 信號通路、Calcium 信號通路（圖4B）。根據(jù)文獻報道，在這些通路中，Ras 信號通路和PI3K-Akt信號通路在AD 發(fā)生過程中起著重要作用，AD 發(fā)生過程中Ras表達增加激活糖原合成酶激酶3（GSK-3），導致APP和Tau過度磷酸化，引起AD 大腦中的β淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)[16,17]。同時Ras 蛋白作為信號通路的分子開關(guān)，調(diào)控下游PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路，參與氧化應激、自噬、凋亡、炎癥反應等多種生物學過程[18,19]。而PI3K-Akt 信號通路、NFκB 信號通路、TNF 信號通路等參與神經(jīng)炎癥反應，與AD發(fā)生也密切相關(guān)。

3.4 AD細胞模型構(gòu)建及關(guān)鍵基因的qPCR驗證

SH-SY5Y 細胞衍生于人的神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK2N 2SH，該細胞分化后具有神經(jīng)元樣的形態(tài)，表達神經(jīng)元特異性的標志物，表現(xiàn)出人神經(jīng)元的特性，該細胞系被廣泛運用于神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的研究。本研究以不同濃度Aβ1-42刺激SH-SY5Y細胞構(gòu)建AD 細胞模型，MTT 檢測細胞活力顯示在Aβ1-42刺激后SH-SY5Y 細胞活力隨濃度呈下降趨勢（圖5A），Aβ1-42濃度為10 μm·L-1刺激下細胞生存率為55 ± 6.8%，故選擇10 μm·L-1Aβ1-42建立AD 細胞模型。TRIzol 法提取細胞總RNA 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 后，使用設計好的引物進行qPCR 驗證。結(jié)果顯示，與正常組比較，Aβ1-42處理后EGFR、MMP2 表達明顯下降（P＜0.05），IL1B、BCL2L1、KITLG表達顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖5B），挑選的5個關(guān)鍵基因qPCR表達結(jié)果與芯片結(jié)果一致。

圖5 AD細胞模型的建立及關(guān)鍵基因的qPCR驗證

4 討論

大腦海馬區(qū)屬于腦的邊緣系統(tǒng)（limbic system）中的重要結(jié)構(gòu)，與學習、記憶、認知功能有關(guān)，尤其是短期記憶與空間記憶[20]。大量研究證實海馬的損傷會導致長期情景記憶的嚴重損害，這表明海馬在學習和記憶中起著重要作用[21,22]，特別是CA1 區(qū)被認為是長時程增強效應形成的關(guān)鍵部位，因為它是介于海馬和皮質(zhì)/皮質(zhì)下區(qū)域之間的信息通道[23,24]。AD 患者與非癡呆患者的大腦相比，海馬CA1 區(qū)通常表現(xiàn)出明顯的萎縮，神經(jīng)元和突觸的數(shù)量減少[25]。近年來，有學者提出CA1 區(qū)的病理改變是認知障礙患者記憶功能障礙的重要指標[26]。

目前普遍認為，在AD的病理過程中，tau蛋白過度磷酸化導致的細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）、細胞外淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）積聚所形成的老年斑是AD 發(fā)生的主要病理生理機制[27]。為了進一步了解核心基因在AD中的作用，我們從GEO數(shù)據(jù)庫獲取了不同時期AD患者大腦CA1區(qū)灰質(zhì)的基因表達譜，運用生物信息學方法篩選出在AD 發(fā)生的不同時期均出現(xiàn)表達異常的基因并構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡，這些基因的異常表達引起蛋白相互作用網(wǎng)絡調(diào)控異?？赡苁菍е翧D 出現(xiàn)病理特征的關(guān)鍵所在[28]，因此我們進一步分析PPI 網(wǎng)絡獲取了網(wǎng)絡中相互作用最多的12個關(guān)鍵靶點，這些關(guān)鍵基因的失調(diào)可能是導致AD 發(fā)生的重要因素，它們也可能是治療AD的潛在生物標志物或藥物靶點。

為了進一步明確關(guān)鍵基因在AD 發(fā)生過程中發(fā)揮的生物學功能，我們利用DAVID 數(shù)據(jù)庫和Omicshare在線分析工具對這些關(guān)鍵基因進行生物學過程和代謝通路的富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要與一氧化氮合酶活性調(diào)節(jié)、細胞凋亡、缺氧反應、炎癥反應等密切相關(guān)。我們結(jié)合文獻檢索分析結(jié)果預測AD 的不同階段海馬CA1 區(qū)差異表達的基因與AD 發(fā)生的聯(lián)系主要為：①神經(jīng)炎癥反應及相關(guān)通路的調(diào)控是影響AD 發(fā)生發(fā)展的重要機制。Aβ 的沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)引起神經(jīng)元炎癥反應，神經(jīng)炎癥反應的激活伴隨著許多促炎因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）、白介素6（IL-6）以及活性氮及活性氧的釋放，促炎因子毒性作用的累積會導致慢性神經(jīng)炎癥，從而引起神經(jīng)元死亡[29]。炎性細胞因子的釋放又可以反過來促進β 淀粉樣前體蛋白的表達，進一步促進AD 的發(fā)生[30]。②PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、以及NF-κB信號通路在內(nèi)的炎癥反應途徑介導了神經(jīng)炎癥的發(fā)生機制。多種介質(zhì)和信號通路之間復雜的相互作用產(chǎn)生各種炎癥因子和神經(jīng)炎性反應促進AD 的發(fā)生發(fā)展。細胞外介質(zhì)可調(diào)節(jié)不同的信號級聯(lián)，導致神經(jīng)元細胞生存或死亡，發(fā)揮最終的神經(jīng)系統(tǒng)功能，其中PI3K/AKT、MAPK 在激活NF-κB 中發(fā)揮重要作用[31,32]。在AD 進展過程中，NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑在炎癥，神經(jīng)元存活，分化，細胞凋亡，神經(jīng)突生長，突觸可塑性發(fā)揮重要作用[33]。在AD 中，Aβ 刺激促使NF-κB 被激活，產(chǎn)生大量的促炎細胞因子，進而作用于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，誘導其表達更多的細胞因子和趨化因子，形成惡性循環(huán)，也間接促進了神經(jīng)元死亡[34]。

本研究采用生物信息學方法分析不同階段AD 患者海馬CA1 區(qū)差異表達的基因，以闡明AD 發(fā)生的分子機制。結(jié)果表明一些基因的表達失調(diào)可能是導致AD 發(fā)生的重要因素，這些關(guān)鍵基因可能通過神經(jīng)炎癥影響AD 的發(fā)生發(fā)展，證實了神經(jīng)炎癥促進AD 的發(fā)病的關(guān)系，對AD 治療的潛在生物標志物或藥物靶點的研究有重要意義。