單春蘭，高飛龍，劉超英，劉海峰，高 洪*，嚴(yán)玉霖，楊 偉，王 浩

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南 昆明 650201； 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】隨著人類(lèi)生活水平的不斷提高，食品安全問(wèn)題和自身健康問(wèn)題越來(lái)越引起了人們的普遍關(guān)切?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘇丹紅I(Sudan I)是一種人工合成的親脂性偶氮化合物，常用于工業(yè)生產(chǎn)中，其可通過(guò)多種途徑代謝，在代謝過(guò)程中產(chǎn)生活性氧，主要作用與肝臟靶器官。Sudan I及其代謝產(chǎn)物能夠?qū)е录?xì)胞不斷分裂和增殖，并能抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Omura等在1964年于大鼠的肝微粒體中發(fā)現(xiàn)的酶系CYP 450s(Cytochrome P450s，CYPs)，分布于哺乳動(dòng)物的肝、胃腸道、腎、腦、肺、皮膚及胎盤(pán)組織[1-2]。其中肝臟是其含量最高的場(chǎng)所，存在于肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核膜上。CYP 450s是存在于肝臟內(nèi)重要的藥物代謝酶，主要參與了內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)在肝臟內(nèi)的代謝，也是致癌物代謝活化的一類(lèi)重要酶系[3-5]。CYP 2家族細(xì)胞色素中CYP 2E1可被乙醇等化合物誘導(dǎo)，是參與N-亞硝胺、苯胺、鹵代烴類(lèi)等多種前致癌物代謝為終致癌物的主要酶類(lèi)[6]。CYP 3A能被多種化合物所誘導(dǎo)，在許多毒理學(xué)和藥物代謝方面具有重要意義[7]。血液成分中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白對(duì)機(jī)體發(fā)生病理改變最具有診斷參考價(jià)值[8]。白細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，數(shù)目增高見(jiàn)于急性中毒、組織損傷、細(xì)菌病毒的感染等等；紅細(xì)胞數(shù)目的減少見(jiàn)于造血發(fā)生障礙容易形成貧血或受到物理化學(xué)因素破壞；血小板量數(shù)目增高表現(xiàn)血液粘稠度增大，血栓形成等疾??；血紅蛋白反應(yīng)機(jī)體的貧血程度[9]。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)研究擬用對(duì)照組(C組)、Sudan I處理組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，建立肝臟病理性損傷的中毒動(dòng)物模型?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用酶活性的測(cè)定和血液分析探討CYP 450s酶系活性的變化，對(duì)闡明Sudan I致肝損傷機(jī)理以及建立Sudan I中毒病理性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

蘇丹紅I(Sudan I)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基比林，購(gòu)于上海國(guó)藥公司；BCA蛋白定量測(cè)試盒，購(gòu)于昆明峰大進(jìn)出口有限公司；還原性輔酶II、紅霉素，購(gòu)于Roche公司；蔗糖、連二亞硫酸鈉(保險(xiǎn)粉)、氯化鈣、硫酸、硫酸鋅、醋酸胺、氫氧化鋇、乙酰丙酮、甲酸、氯仿、異丙醇、乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

HWS-20型恒溫水浴箱，購(gòu)于江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PHB-3pH酸度計(jì)，購(gòu)于寧波石浦海天電子儀器廠；LD4-2A型低速離心機(jī)，購(gòu)于北京醫(yī)用離心機(jī)廠；DANGERSJ-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，購(gòu)于蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；Beckman 超速冷凍離心機(jī)，購(gòu)于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

30只清潔級(jí)SD大鼠，體重140～160 g/只，雌(無(wú)孕)雄不拘，昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。臨床檢查確認(rèn)健康后，單籠預(yù)飼養(yǎng)3 d，自由飲水采食，編號(hào)并隨機(jī)分為Sudan I處理組(I, II, III和 IV組)和C組，每組6只。

將Sudan I與飼料按一定比例充分混勻，配制成4個(gè)不同劑量的顆粒飼料，分別飼喂Sudan I處理組：I組(265 mg/kg)、II組(530 mg/kg)、III組(795 mg/kg)和 IV組(975 mg/kg)，連續(xù)飼喂10 d。C組飼以普通顆粒飼料，飼喂與處理組相同天數(shù)。

1.4 肝臟微粒體的制備

末次給藥后，大鼠禁食12 h，處死大鼠后立即剖腹，取肝剪碎(本實(shí)驗(yàn)所用肝組織均為同一肝葉)，采用鈣離子沉淀法制備肝微粒體，參照徐叔云等主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10]提供的方法，用0.9 %生理鹽水(0～4 ℃)反復(fù)沖洗肝臟，吸干后稱重。取一定量的肝臟按1∶4加入0.25 mol/L蔗糖溶液制備20 %的組織勻漿，高速離心(4 ℃，12 500 r/min，25 min)，取上清液置離心管，加入88 mmol/L氯化鈣溶液混勻，使其終濃度為8 mmol/L，靜置5 min，輕輕顛倒數(shù)次，離心(4 ℃，27 000 r/min，15 min)，加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀，再次離心(4 ℃，27 000 r/min，15 min)，棄上清液，得到的粉紅色沉淀即為微粒體，將其加入含20 %甘油的磷酸鹽緩沖液中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ陨喜襟E均在冰浴上進(jìn)行。

1.5 血液樣品的采集

處死大鼠后，摘眼球采血，血液滴入含抗凝劑的離心管中，用于檢測(cè)并分析血成分指標(biāo)。

1.6 樣品的測(cè)定

1.6.1 微粒體蛋白濃度的測(cè)定 采用BCA法測(cè)定微粒體蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)得蛋白的含量。用公式(1)計(jì)算微粒體蛋白濃度。

蛋白濃度(g/L)=

(1)

1.6.2 CYP 450含量的測(cè)定 組織樣品用磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)蛊涞鞍诐舛却蠹s為0.5 mg/mL，將待測(cè)組織樣品中加入比色皿中。將配置好的0.1 g/mL連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)20 μl加入比色皿中混勻，靜置30 s。取出比色杯，充CO氣體40 s(速度應(yīng)該緩慢，以氣泡連續(xù)，液體不溢出為準(zhǔn))然后放回原位，1 min后測(cè)定450與490 nm處的吸光度差值。按公式(2)計(jì)算CYP 450的含量：

(2)

1.6.3 CYP 2E1、CYP 3A1酶活性的測(cè)定 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別取0、25、50、100、150和200 μl的0.1 mmol/L甲醛溶液，各加入去離子水補(bǔ)至1 mL，再分別加入Nash試劑1 mL，50 ℃水浴30 min，冷卻后，空白管調(diào)零，420 nm處測(cè)定OD值，以甲醛濃度為橫坐標(biāo)，OD為縱坐標(biāo)，求出線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r值。組織樣品酶活性的測(cè)定操作(表1)。

表1 試劑、待測(cè)樣品的劑量

空白管調(diào)零，420 nm處測(cè)定吸光度OD值，計(jì)算酶活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甲醛的濃度，酶活性按公式(3)計(jì)算。

酶活性(μmol/g/min)=

(3)

1.6.4 血液樣品的測(cè)定 采用半自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀，測(cè)定血成分。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP 2E1和CYP 3A1酶活性的變化情況

2.1.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取0、25、50、100、150和200 μl的0.1 mmol/L甲醛溶液，加入去離子水補(bǔ)至1 mL，則對(duì)應(yīng)濃度分別0、2.5、5、10、15、20 μmol/L。420 nm處測(cè)定OD值，以甲醛濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。

從圖1顯示甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到很好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.0231x+0.0259，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9926。

圖1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of HCHO

2.1.2 CYP2E1、CYP3A1酶活性的變化 CYP 2E1酶在C、I, II, III和 IV組活性分別為132.17、164.5、211.67、209.00和203.67 nmol/g·min，結(jié)果顯示Sudan I處理組CYP 2E1酶活性顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)；CYP 3A1酶在C、I, II, III和 IV組活性分別為24.83、47.33、50.17、70.33和68.33 nmol/g·min，顯示CYP 3A1酶活性顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)。且在一定得劑量范圍內(nèi)，二者活性均有增長(zhǎng)趨勢(shì)。

2.2 CYP 450含量的變化

Sudan I處理組(I, II, III和 IV)的CYP 450含量顯著高于C組(P<0.05)，且在一定得劑量范圍內(nèi)，隨劑量上升而增加(表4)。

2.3 血液成分的變化

白細(xì)胞數(shù)目在Sudan I處理組(III和 IV)極顯著高于C組(P<0.01)；紅細(xì)胞數(shù)目在Sudan I處理組(II, III和 IV)顯著低于C組(P<0.01，P<0.05)。血小板含量在Sudan I處理組(II, III和 IV)顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)；血紅蛋白含量在Sudan I處理組(II, III和 IV)顯著低于C組(P<0.01，P<0.05)。變化趨勢(shì)為在一定劑量范圍內(nèi)，隨Sudan I劑量的增加，白細(xì)胞數(shù)目增加，紅細(xì)胞數(shù)目減少，血小板含量增加，血紅蛋白含量減少(表5)。

3 討 論

3.1 Sudan I對(duì)CYP 2E1、CYP 3A1酶活性及CYP 450含量的影響

進(jìn)入體內(nèi)的Sudan I在肝臟細(xì)胞的還原酶作用下被分解生產(chǎn)具有強(qiáng)烈毒性的1-氨基-2-奈酚和苯胺，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)核物質(zhì)的損傷，或與 DNA、RNA 形成加合物[11]，會(huì)導(dǎo)致癌變，畸變的可能性，并且具有致敏性和遺傳毒性等潛在威脅。嚴(yán)玉霖等[12]報(bào)道， Sudan I能引起肝臟組織細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，能顯著上調(diào)大鼠肝臟 CYP 1A1基因的表達(dá)，從而促進(jìn) Sudan I在體內(nèi)代謝成有毒物質(zhì)。機(jī)體發(fā)生中毒致使肝細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞器的損傷是無(wú)選擇性，這主要是通過(guò)肝臟CYP 450s酶系代謝產(chǎn)生的毒性產(chǎn)物，如親電子基、自由基、氧自由基等的作用引起線粒體、細(xì)胞核等生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，使膜流動(dòng)性降低、通透性升高、膜酶活性改變、膜受體失活，從而破壞膜結(jié)構(gòu)與功能，還會(huì)引起其他細(xì)胞器和整個(gè)細(xì)胞的變化，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞，失去膜的完整性[13-14]。CYP 2E1可被乙醇等化合物誘導(dǎo)，是參與N-亞硝胺、苯胺、鹵代烴類(lèi)等多種前致癌物代謝為終致癌物的主要酶類(lèi)[6]細(xì)胞色素的合成和催化活性水平可隨著接觸的環(huán)境因素而改變，導(dǎo)致疾病易感性的不同。如果CYP450s代謝芳香族外源化合物，那么CYP 450s表現(xiàn)為活性增強(qiáng)，含量增加。

表2 甲醛濃度OD值

表3 大鼠肝微粒體CYP2E1和CYP3A1的活性

注：*和**分別表示在P<0.05或P<0.01水平下達(dá)到顯著差異。下同。

Note:* and** indicated significant difference atP<0.05 orP<0.01 levels, respectively. The same as below.

表4 大鼠肝微粒體中CYP 450含量

采用酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，Sudan I處理組CYP 450s含量明顯高于C組，CYP 2E1、CYP 3A1酶活性在Sudan I不同劑量組顯著高于C組，且隨著劑量增加而呈上升趨勢(shì)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Sudan I處理組與C組相比，大鼠肝微粒體CYP 450s含量、CYP 2E1和CYP 3A1酶活性表現(xiàn)為增強(qiáng)。說(shuō)明Sudan I影響了肝臟CYP 450s酶系統(tǒng)，而CYP 450含量、CYP 2E1和CYP 3A1活性的增強(qiáng)影響了肝臟細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致機(jī)體肝臟的損傷。

表5 SudanⅠ對(duì)大鼠血液成分的變化

3.2 SudanⅠ對(duì)血液成分的影響

機(jī)體血液在全身進(jìn)行大小循環(huán)，流向各個(gè)組織器官，參與機(jī)體的新陳代謝，調(diào)節(jié)和維護(hù)機(jī)體各機(jī)能活動(dòng)和內(nèi)外環(huán)境的平衡，血液中的白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血小板量和血紅蛋白量最具有診斷參考價(jià)值。白細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，數(shù)目增高見(jiàn)于急性中毒；紅細(xì)胞數(shù)目的減少見(jiàn)于造血發(fā)生障礙容易形成貧血；血小板量數(shù)目增高表現(xiàn)血液粘稠度增大，導(dǎo)致血液疾病的發(fā)生；血紅蛋白反應(yīng)機(jī)體的貧血程度[9]。測(cè)定血液中白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及血小板量結(jié)果表明，隨著Sudan I處理劑量的增加，紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白的量減少，白細(xì)胞數(shù)和血小板的量增加。顯示Sudan I可改變血液成分中紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白量和血小板量。暗示機(jī)體已經(jīng)發(fā)生貧血和中毒。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明Sudan I可促使肝CYP 450含量、CYP 2E1和CYP 3A1酶活性的升高，顯示Sudan I對(duì)血液細(xì)胞數(shù)量變化有影響，并破壞了血液中的血紅蛋白和血小板。在Sudan I致大鼠肝損傷的發(fā)生過(guò)程中，表明肝CYP 450、CYP 2E1和CYP 3A1發(fā)揮了重要作用，且對(duì)大鼠的造血機(jī)能產(chǎn)生了影響。