徐欣如，查建軍，張明珠，孫慶業(yè)

(安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

【研究意義】氮循環(huán)是N2、無(wú)機(jī)氮化合物、有機(jī)氮化合物在自然界中相互轉(zhuǎn)化過(guò)程的總稱，是重要的微生物化能過(guò)程，包括氨化、硝化、反硝化、固氮作用等[1]。由于氮轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及農(nóng)田氮肥有效性、水體富營(yíng)養(yǎng)化等，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在氮循環(huán)方面進(jìn)行了廣泛的研究。土壤中的硫主要以硫酸鹽形式存在，硫酸鹽的還原過(guò)程在土壤硫循環(huán)中占據(jù)位置，其主要執(zhí)行者為硫酸鹽還原菌[2]。因此研究土壤中氮硫轉(zhuǎn)化功能基因及其與土壤元素循環(huán)過(guò)程的關(guān)系具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，環(huán)境介質(zhì)中參與氮、硫轉(zhuǎn)化的功能微生物及其攜帶的基因受到了廣泛的關(guān)注。研究表明，反硝化菌與厭氧氨氧化菌之間存在協(xié)同和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[3]，土壤層次的變化能夠影響氨氧化的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度[4]，C/N比大于6時(shí)，可限制上覆水中功能基因amoA-AOA的生長(zhǎng)，抑制氨氧化過(guò)程的進(jìn)行[5]，硫酸鹽含量會(huì)影響硫酸鹽還原過(guò)程[6]。作為一種環(huán)境介質(zhì)，多種元素的轉(zhuǎn)化過(guò)程在土壤中同時(shí)進(jìn)行，且不同元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程相互聯(lián)系、相互影響，如硫酸鹽還原過(guò)程能夠促進(jìn)固氮過(guò)程、其產(chǎn)物能夠抑制氨氧化過(guò)程[7]。土壤是固、氣和液三相統(tǒng)一體，土壤中參與氮、硫循環(huán)的微生物除附著于土壤顆粒外，還有一部分生活于土壤的孔隙水中。目前，關(guān)于土壤中參與氮硫循環(huán)微生物的研究多以土壤整體作為研究對(duì)象[8-9]，而關(guān)于土壤孔隙水的研究多集中于孔隙水中的污染物質(zhì)和理化指標(biāo)分析[10]，對(duì)于土壤顆粒和懸浮于孔隙水中微生物的變化以及與孔隙水理化性質(zhì)的關(guān)系還缺乏深入研究，土壤孔隙水的理化性質(zhì)與參與氮硫轉(zhuǎn)化功能基因豐度之間關(guān)系的研究相對(duì)較少。酸性礦業(yè)廢水是含硫化物的礦物與水、氧氣、微生物相互作用產(chǎn)生的，它們是礦山環(huán)境污染的重要來(lái)源[11]。酸性礦業(yè)廢水的典型特點(diǎn)是低pH、高硫酸鹽含量，以及含有大量的污染性金屬離子[12]，這些廢水不僅會(huì)造成地表和地下水污染，還會(huì)導(dǎo)致周邊土壤質(zhì)量退化，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[13]。目前針對(duì)酸性礦業(yè)廢水污染土壤的研究側(cè)重于重金屬污染，而忽略了對(duì)土壤中微生物群落以及功能基因的影響。銅陵是我國(guó)有色金屬基地之一，伴隨礦產(chǎn)資源開采形成了大量的酸性礦業(yè)廢水。這些酸性礦業(yè)廢水通過(guò)不同的途徑進(jìn)入周圍農(nóng)田，并隨著土壤孔隙水向下滲透進(jìn)入深層土壤，從而對(duì)土壤造成污染?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以安徽省銅陵市某處受酸性礦業(yè)廢水污染的農(nóng)田作為研究對(duì)象，基于熒光定量PCR技術(shù)分析了土壤剖面不同深度孔隙水中某些參與N、S轉(zhuǎn)化的功能基因的豐度，闡明受污染農(nóng)田土壤孔隙水中影響參與氮硫轉(zhuǎn)化的微生物功能基因豐度的主要因子，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為揭示酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤中的氮硫循環(huán)過(guò)程以及酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤生態(tài)修復(fù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于安徽省銅陵市某礦區(qū)附近(30°50′～30°58′ N，117°50′～118°10′ E)，為亞熱帶氣候，無(wú)霜期有237～258 d，全年平均氣溫16.2 ℃，平均濕度在75 %～81 %之間，年均降雨量1346 mm，雨季集中在7-9月份[14]。所研究區(qū)域農(nóng)田由于長(zhǎng)期受酸性礦業(yè)廢水的影響，具有低營(yíng)養(yǎng)、高鹽、高重金屬的特點(diǎn)，農(nóng)作物的產(chǎn)量較低，某些作物甚至無(wú)法生長(zhǎng)。

1.2 樣品采集與分析方法

1.2.1 水樣的采集 在供試農(nóng)田內(nèi)設(shè)置4個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)在0～20、20～40、40～60、60～80、80～100、100～150 cm各安裝1根采水管( 圖1)。采水管的設(shè)計(jì)為雙層PVC管結(jié)構(gòu)，內(nèi)管外徑3 cm、長(zhǎng)度40 cm，管壁布設(shè)均勻小孔，內(nèi)管外包裹400目的尼龍網(wǎng)，防止泥沙進(jìn)入；外管外徑5 cm、長(zhǎng)度44 cm，上半段設(shè)有進(jìn)水孔，外管兩端用硅膠塞密封，并設(shè)置一根軟管用于取水。為減少安裝過(guò)程對(duì)土壤的擾動(dòng)，鉆孔后將采水管直接插入到預(yù)定深度，鉆孔所用鉆頭的外徑與采水管的外徑一致。2016年8月完成采水管野外安裝工作，采水管在土壤剖面中穩(wěn)定1個(gè)月后，10月份采集土壤孔隙水樣。

利用真空泵將孔隙水快速抽入到含2 cm厚石蠟層的滅菌樣品瓶中。所采集的水樣一部分用于測(cè)定孔隙水中的還原性物質(zhì)(S2-)，另一部分水樣過(guò)0.22 μm濾膜后用于測(cè)定水樣的其他理化性質(zhì)，濾膜上的殘留物用于提取水中的微生物DNA及功能基因分析。

圖1 土壤孔隙水采集管示意圖Fig.1 Illustration of design used to monitor pore water

功能基因Target gene引物Primers引物序列 (5’-3’)Prime sequence (5’-3’)amoA-AOAamoA-1F/amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCamoA-AOBArch-amoAF/Arch-amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACGGCGGCCATCCATCTGTATGTnirKCd3aF/R3cdGTSAACGTSAAGGAACSGGGASTTCGGRTGSGTCTTGAnirSnirK876/nirK1040ATCATGGTSCTGCCGCGGCCTCGATCAGRTTGTGGTTnosZnosZ2F/nosZ2RCGCRACGGCAASAAGGTSMSSGTCAKRTGCAKSGCRTGGCAGAAdsrBDSRp2060F/DSR4RCAACATCGTYCAYACCCAGGGGTGTAGCAGTTACCGCA

微生物總DNA采用CTAB法提取[12]。熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)測(cè)定孔隙水中各功能基因的豐度[2,17]。qPCR反應(yīng)在ABI step-one system擴(kuò)增儀上根據(jù)KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix試劑的說(shuō)明書進(jìn)行，產(chǎn)物的特異性用溶解曲線以及凝膠電泳確定，不同功能基因的qPCR引物及引物序列見表1[18-23]。qPCR的擴(kuò)增效率為80 %～90 %，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2> 0.99。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

Excel 2007用于計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并繪制表格；SPSS 19.0用于差異顯著性檢驗(yàn)( Duncan法) 和相關(guān)性分析( Pearson法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤剖面孔隙水理化性質(zhì)

2.1.1 土壤剖面孔隙水的pH和電導(dǎo)率 從表2可以看出，土壤剖面孔隙水pH的變化范圍為7.06～7.33，EC的變化范圍為104～199 μs/cm。隨著剖面深度的增加，孔隙水pH逐漸降低，而EC則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。pH的最小值及EC的最大值均出現(xiàn)在80～100 cm剖面層，其中，0～20 cm剖面層的pH顯著高于80～100 和100～150 cm(P<0.05)，而0～20 cm剖面層的EC則顯著低于80～100 和100～150 cm(P<0.05)。上述結(jié)果表明，土壤剖面孔隙水的pH和EC隨剖面深度變化較為明顯。

2.2 土壤剖面孔隙水中N、S代謝功能基因的豐度

如表4所示，土壤孔隙水0～20 cm層功能基因amoA-AOA與amoA-AOB的比率約為5，隨著剖面深度的增加，二者的比率也逐漸增加，100～150 cm層時(shí)二者的比率達(dá)到38.92；各層孔隙水中nirS基因豐度均大于nirK；5種參與N轉(zhuǎn)換的功能基因中，nosZ基因豐度最大。參與硫還原功能基因dsrB的豐度整體上高于參與N轉(zhuǎn)換的功能基因，且在60～80 cm層時(shí)豐度達(dá)到最大，為1.96×109copies/mL。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明，不同剖面深度6種功能基因豐度均無(wú)顯著差異。

表2 孔隙水中C、N含量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

注：同一列中不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Notes: Different letters within a column indicate the significant differences among treatments at 0.05 level. The same as below.

表3 孔隙水中污染物特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

如表5所示，土壤剖面孔隙水中參與氨氧化的功能基因amoA-AOA與amoA-AOB呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，參與反硝化的3個(gè)功能基因nirS、nirK、nosZ呈顯著或極顯著正相關(guān)。來(lái)自于氨氧化古菌的amoA-AOA與反硝化功能基因nirS、nirK和nosZ也呈顯著或極顯著正相關(guān)，但源于細(xì)菌的amoA-AOB僅與nirK具有較好的相關(guān)性。

2.3 功能基因豐度與孔隙水理化性質(zhì)的相關(guān)性

如表6所示，不同環(huán)境因子對(duì)N、S轉(zhuǎn)化功能基因豐度的影響，其中，EC、亞硝氮與dsrB基因呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；Cu與amoA-AOA、nirS基因呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

3.1 土壤孔隙水中功能基因的關(guān)系

氨氧化過(guò)程將氨氧化為亞硝氮，是硝化作用的第一個(gè)反應(yīng)步驟，既是限速步驟，也是氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)[24]。參與氨氧化的功能基因amoA-AOA與amoA-AOB的比率在一定程度上可以反映環(huán)境氧含量、營(yíng)養(yǎng)等條件。Santoro[25]在測(cè)定地下河口沉積物中amoA基因豐度時(shí)發(fā)現(xiàn)，amoA-AOA在低氧環(huán)境中是amoA-AOB的10倍，但在好氧環(huán)境中amoA-AOB卻是amoA-AOA的約30倍。在本研究中，隨著土壤剖面深度的增加，參與氨氧化的功能基因amoA-AOA與amoA-AOB豐度的比率也逐漸增加，0～20 cm層時(shí)amoA-AOA/amoA-AOB比率約為5，而在100～150 cm層時(shí)，amoA-AOA與amoA-AOB的比率增加到約39。這種比率的變化趨勢(shì)可能與功能基因的生理代謝機(jī)制有關(guān)，在系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化方面，amoA-AOA形成了一類完全獨(dú)立于amoA-AOB的進(jìn)化分支，它既可進(jìn)行自養(yǎng)代謝，也可以通過(guò)混合營(yíng)養(yǎng)方式生活[26]，因此，在氧氣含量不充足的情況下，amoA-AOA的豐度優(yōu)勢(shì)逐漸明顯。與土壤剖面0～20 cm層相比，位于100～150 cm深度的土壤孔隙水中基本處于厭氧狀態(tài)，這也是導(dǎo)致該層具有較高amoA-AOA豐度的原因。

表4 土壤孔隙水中參與N、S代謝功能基因的豐度(copies/mL，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

表5 孔隙水中N、S代謝功能基因的相關(guān)性

注：*表示在0.05水平上具有顯著相關(guān)性，**表示在0.01水平上具有顯著相關(guān)性，下同。

Notes: *stand for significance at 0.05 level, and **stand for significance at 0.01 level. The same as below.

表6 孔隙水中N、S代謝功能基因與理化性質(zhì)的相關(guān)性

相關(guān)分析(表5)還表明，孔隙水中參與氨氧化過(guò)程和反硝化過(guò)程的功能基因之間存在較好的相關(guān)性，可能是由于氨氧化過(guò)程增加了氧化態(tài)氮的供應(yīng)，從而促進(jìn)了反硝化過(guò)程的進(jìn)行[28]。

有研究表明，硫酸鹽還原過(guò)程對(duì)反硝化過(guò)程存在雙方面的影響：一方面，硫酸鹽還原過(guò)程的中間產(chǎn)物(單質(zhì)硫)，可以作為部分自養(yǎng)反硝化菌的電子供體[29]；另一方面，硫酸鹽還原過(guò)程會(huì)對(duì)反硝化過(guò)程中氧化亞氮還原為氮?dú)怆A段的酶(nosZ編碼的酶)產(chǎn)生抑制作用，使得反硝化過(guò)程無(wú)法完全進(jìn)行[30]。本研究中，dsrB基因與參與N轉(zhuǎn)化的功能基因之間并未表現(xiàn)出相關(guān)性(表5)，具體原因有待于進(jìn)一步探討。

3.2 土壤孔隙水理化因子對(duì)功能基因豐度的影響

酸性礦業(yè)廢水進(jìn)入農(nóng)田后不僅可導(dǎo)致土壤中Fe、Mn、Cu及硫酸根含量的增加[31]，而且還會(huì)影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[32]。在本研究中，土壤孔隙水中Cu對(duì)amoA-AOA基因豐度起到了顯著促進(jìn)作用(r= 0.430，P<0.05)。Walker[33]在對(duì)海洋中硝化機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，amoA-AOA基因的能量代謝依賴于含有Cu而非Fe的電子傳遞系統(tǒng)，這可能會(huì)影響氨氧化菌對(duì)重金屬Cu 的敏感性，這也可能就是本研究孔隙水中amoA-AOA基因豐度與重金屬Cu含量呈顯著正相關(guān)性的原因。

在本研究中，孔隙水中dsrB基因豐度與EC呈顯著正相關(guān)(r= 0.412，P<0.05)。硫酸鹽還原菌主要參與硫酸根的還原作用[34]，酸性礦業(yè)廢水中主要的陰離子即為硫酸根離子[35]，而硫酸根又是決定酸性礦業(yè)廢水電導(dǎo)率的關(guān)鍵因素，因此dsrB基因豐度與EC呈顯著正相關(guān)是很容易理解的。

4 結(jié) 論

酸性礦業(yè)廢水污染土壤剖面的孔隙水中參與N、S轉(zhuǎn)化的6種功能基因豐度受剖面深度的影響較小，但amoA-AOA與amoA-AOB豐度的比率則隨著剖面深度的增加而增加；nirK基因?qū)Νh(huán)境因子的響應(yīng)較nirS更為敏感，基因豐度整體上低于nirS基因；5種參與N轉(zhuǎn)化的功能基因(amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS和nosZ)之間表現(xiàn)出較好的相關(guān)性；土壤孔隙水的EC、亞硝氮含量影響dsrB基因的豐度，孔隙水中Cu對(duì)amoA-AOA和nirS基因豐度產(chǎn)生顯著影響。總的來(lái)說(shuō)，酸性礦業(yè)廢水污染農(nóng)田土壤剖面孔隙水中氮轉(zhuǎn)化功能基因之間相互作用，功能基因豐度與剖面深度和孔隙水理化性質(zhì)關(guān)系密切。