李星月, 肖連康, 李其勇, 曹坳程, 洪 杰, 朱從樺, 符慧娟, 張 鴻*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；2.涼山州植物檢疫站，四川 西昌 615000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

【研究意義】草莓(FragariaananassaDuch)作為一種兼具營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果，在我國主要經(jīng)濟(jì)作物中占有重要地位，長期保持著大規(guī)模的種植水平，并呈現(xiàn)出穩(wěn)定增長的趨勢[1-2]。作為我國草莓的主要產(chǎn)地之一，四川省的草莓種植歷史悠久，目前全省栽培面積和產(chǎn)量全國第一。草莓生長的極限溫度為-5 ℃，而涼山州德昌縣由于地處低緯度高原的亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，冬春兩季的光熱資源豐富，最冷月平均溫度在10 ℃以上，是難得的高山露天草莓生產(chǎn)區(qū)，草莓生產(chǎn)中僅需地膜覆蓋即可安全越冬[3]。德昌草莓種植始于1986年，初期以適應(yīng)本地種植的“寶交”早生品種為露地主栽品種，自20世紀(jì)90年代初農(nóng)戶自主引進(jìn)“豐香”之后，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和草莓種植效益提升，德昌開展一系列草莓引進(jìn)新品種試驗(yàn)，篩選出的主栽品種“甜查理”占種植面積的90 %以上[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】露地草莓與溫室草莓一樣，都主要采用一年一栽的栽培模式，由于耕地限制等客觀條件，露地草莓的連作栽培現(xiàn)象也普遍存在。連作栽培容易造成草莓生產(chǎn)中的土傳病害加劇、土壤養(yǎng)分失衡、土壤理化性狀劣變、土壤酶活性下降，加上化感物質(zhì)不斷積累、土壤酸化等連作效應(yīng)發(fā)生，后茬草莓植株生長發(fā)育受阻、產(chǎn)量與品質(zhì)下降，嚴(yán)重阻礙了露地草莓生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[5-7]。此外，根際是植物生態(tài)系統(tǒng)和土壤生態(tài)系統(tǒng)交叉形成的特殊區(qū)域，農(nóng)作物連作障礙與根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，作物連作打破了根際土壤微生物生態(tài)平衡，進(jìn)而導(dǎo)致有益微生物減少和病原微生物的積累[8-10]。真菌是土壤微生物的重要成員，推動(dòng)著土壤生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，在土壤中發(fā)揮著重要的分解作用[8]。目前，高通量測序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中具有很大優(yōu)勢，可以直接測定環(huán)境樣品中的基因組片段，具有測序通量高，效率高和重復(fù)性好的特點(diǎn)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究運(yùn)用Illumina高通量測序技術(shù)研究非連作栽培露地草莓、連作栽培未發(fā)生連作障礙露地草莓和發(fā)生連作障礙露地草莓的根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，探討連作栽培對(duì)露地草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為改善連作土壤生態(tài)環(huán)境、解決露地草莓連作障礙提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采集于四川省涼山州德昌縣小高鄉(xiāng)露地草莓栽培基地(27°35′N，102°28′E，海拔1295 m)，種植品種為“甜查理(Sweet Charlie)”，在草莓初果期(12月20日)，隨機(jī)選取非連作栽培露地草莓(S0_Fu)、連作栽培(10年)未發(fā)生連作障礙露地草莓(S1_Fu)和連作栽培(10年)發(fā)生連作障礙露地草莓(S2_Fu)的各1塊地，用抖落法分別取每塊地6處樣地根際0～20 cm處土壤均勻混合，將混合土樣裝入無菌EP 管，用冰盒保存，立即帶回微生物實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存。

1.2 主要試劑和儀器

美國Omega土壤DNA 提取試劑盒(E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)，北京華越洋生物科技有限公司；膠回收試劑盒(DP209-02)，北京華越洋生物科技有限公司；引物合成，生工生物工程(上海)股份有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase (MO491L)，北京NEB 有限公司。2700 型PCR 擴(kuò)增儀，美國ABI公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；MiSeq PE300 測序平臺(tái)，美國Illumina 公司。

1.3 土壤總DNA 的提取及16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增

土壤總DNA 基因組采用DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取。真菌菌群用ITS(Internal transcribed spacer)序列高通量測定，遵循Illumina 測序儀文庫構(gòu)建方法，以ITS3-4 為目標(biāo)DNA區(qū)域，采用擴(kuò)增引物為：ITS1：(5′-TCC GTT GGT GAA CCA GCG G-3′)，ITS4 :(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。真菌PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)處理，真菌PCR產(chǎn)物和其他擴(kuò)增片段小于400 bp的PCR產(chǎn)物，選用0.8倍的磁珠處理。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)測序濃度為20 pmol。將樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司在Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于對(duì)reads數(shù)據(jù)的拼接、過濾、去嵌合及非特異性擴(kuò)增序列的數(shù)據(jù)前處理，采用Mothur 軟件進(jìn)行真菌樣品的Alpha多樣性分析，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。使用R軟件對(duì)屬進(jìn)行基于Bray-Curtis的樣本聚類分析，對(duì)豐度前50位的種進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列長度分析

質(zhì)量控制后，各處理的剩余序列都在20 000條以上，其中連作栽培未發(fā)生連作障礙露地草莓(S1_Fu)的剩余序列最多，為26 226條。非連作栽培露地草莓(S0_Fu)中嵌合體數(shù)目最多，為33個(gè)。連作栽培發(fā)生連作障礙露地草莓(S2_Fu)處理后序列平均長度最長，為380.25 bp(表1)。

表1 測序數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)

2.2 真菌多樣性分析

從表2可以看出，各樣品文庫的覆蓋率的值為0.98左右，表明樣本中序列沒有被測出的概率越低，本次測序結(jié)果基本代表樣本的真實(shí)情況。在97 %的相似水平下，進(jìn)行OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，共計(jì)比對(duì)2311個(gè)OTUs。其中，S0_Fu根際土有1088個(gè)OUTs，S1_Fu根際土有877個(gè)OUTs，S2_Fu根際土有833個(gè)OUTs，且3個(gè)處理根際土壤內(nèi)真菌種類存在顯著的差異，其共有OTUs僅為111個(gè)，而多為獨(dú)有的OTUs。

樣品的Alpha 多樣性指數(shù)結(jié)果表明，非連作栽培露地草莓(S0_Fu)根際土的真菌豐富度明顯高于連作露地草莓根際土，連作栽培發(fā)生連作障礙露地草莓(S2_Fu)根際土中的真菌OTU 數(shù)比連作栽培未發(fā)生連作障礙露地草莓(S1_Fu)的根際土中多。非連作栽培露地草莓(S0_Fu)根際土的Chao1 指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于連作栽培露地草莓根際土，其中發(fā)生連作障礙的Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)均小于未發(fā)生連作障礙的露地草莓根際土。綜合考慮了真菌群落的豐富度和均勻度，非連作栽培的Shannon指數(shù)顯著大于連作栽培的露地草莓根際土，連作栽培未發(fā)生連作障礙的根際土Simpson 指數(shù)小于發(fā)生連作障礙的根際土，說明非連作栽培的露地草莓根際土中真菌多樣性最高，發(fā)生連作障礙比未發(fā)生連作障礙的連作根際土真菌多樣性更低。

表3為各處理在門和科2 個(gè)分類水平上真菌菌群的比例。由表1 可知，門分類水平上構(gòu)成露地草莓初果期根際土壤的優(yōu)勢真菌群落為接合菌門(Zygomycota)，分別占全部群落的52.35 %、56.74 %和69.98 %，其他依次為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，而其他雜菌分別占14.96 %、18.42 %和18.75 %。與非連作栽培(S0_Fu)相比，連作栽培(S1_Fu和S2_Fu)可顯著提高接合菌門的真菌豐度和比例，并顯著降低了擔(dān)子菌門、子囊菌門、壺菌門和球囊菌門真菌群落的豐度和比例。連作栽培的條件下，發(fā)生連作障礙(S2_Fu)的根際土中接合菌門豐度和比例都比未發(fā)生連作障礙(S1_Fu)的大，而發(fā)生連作障礙(S2_Fu)的根際土中擔(dān)子菌門、子囊菌門、壺菌門和球囊菌門的真菌群落豐度和所占比例都比未發(fā)生連作障礙(S1_Fu)的小。

科分類水平上構(gòu)成露地草莓初果期根際土壤優(yōu)勢群落依次為接合菌門被孢霉科(Mortierellaceae)、擔(dān)子菌門糞傘科(Bolbitiaceae)、擔(dān)子菌門鬼傘科(Psathyrellaceae)、擔(dān)子菌門未分類或未識(shí)別科(unclassified_Basidiomycota)、擔(dān)子菌門球蓋菇科(Strophariaceae)、接合菌門未分類或未識(shí)別科(unclassified Zygomycota)。其中，接合菌門被孢霉科(Mortierellaceae)的豐度和比例：(S2_Fu)>(S1_Fu)>(S0_Fu)，而擔(dān)子菌門糞傘科(Bolbitiaceae)、擔(dān)子菌門鬼傘科(Psathyrellaceae)、擔(dān)子菌門未分類或未識(shí)別科(unclassified_Basidiomycota)、擔(dān)子菌門球蓋菇科(Strophariaceae)、接合菌門未分類或未識(shí)別科(unclassified Zygomycota)的豐度和比例：(S2_Fu)<(S1_Fu)<(S0_Fu)。

由圖1(見封三)可知，未分類的被孢霉屬(unclassifiedMortierellaceae)為樣本中真菌微生物的絕對(duì)優(yōu)勢類別，在S0_Fu、S1_Fu和S2_Fu根際土壤中的相對(duì)豐度為50.54 %、55.12 %和68.77 %，測序過程中reads數(shù)目分別為12 745、14 457和15 806。與連作栽培相比，非連作栽培的露地草莓根際土壤中紅酵母屬(Rhodotorula)的豐度和相對(duì)豐度明顯較低，而未分類的糞銹傘屬(unclassifiedBolbitiaceae)、鬼傘屬(Coprinellus)的豐度和相對(duì)豐度明顯較高。在連作栽培條件下，紅酵母屬(Rhodotorula)、原球蓋菇屬(Protostropharia)和未分類的無梗囊霉屬(unclassifiedAcaulosporaceae)的豐度在發(fā)生連作障礙(S2_Fu)的根際土中明顯低于未發(fā)生連作障礙(S1_Fu)的根際土中，而未分類的糞銹傘屬(unclassifiedBolbitiaceae)和未分類的傘菌屬(unclassifiedAgaricomycetes)的豐度在發(fā)生連作障礙(S2_Fu)的根際土中明顯高于未發(fā)生連作障礙(S1_Fu)的根際土中。

表2 根際真菌Alpha 多樣性指數(shù)

表3 根際真菌在門和科分類水平的豐度比較

物種豐度熱圖，用物種豐度矩陣?yán)L制，顏色塊代表相對(duì)物種豐度值，顏色越紅表示相對(duì)豐度越高，顏色越藍(lán)反之。熱圖對(duì)樣本做了聚類，樣本菌群分布越類似則樣本距離越近，在圖上方聚類樹中的位置越靠近。由圖2(見封三)可以看出，總體上連作栽培的2個(gè)土樣中真菌種群更為相似，而與非連作栽培相比有較大差異，但各優(yōu)勢類群種在S1_Fu和S2_Fu根際土壤中的豐度和比例也有一定差異，可見連作栽培以及連作障礙的發(fā)生對(duì)露地草莓根際土壤的優(yōu)勢真菌種群產(chǎn)生了一定的影響。其中，糞銹傘科的Bolbitiaceaesp.和鬼傘屬的Coprinellusmarculentus在非連作栽培(S0_Fu)的根際土壤中豐度分別為1979(占比7.85 %)和2046(占比8.11 %)，顯著高于連作栽培的2個(gè)土樣(S1_Fu和S2_Fu)，而棒孢擬盤多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)的豐度顯著低于連作栽培的2個(gè)土樣(S1_Fu和S2_Fu)，且相對(duì)豐度相差均超過10倍。粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)在連作栽培未發(fā)生連作障礙(S1_Fu)的根際土中豐度為2800(占比10.68 %)，顯著高于發(fā)生連作障礙(S2_Fu)的根際土中的豐度460(占比2.00 %)，原球蓋菇屬的Protostrophariaalcis、無梗囊霉科的Acaulosporaceaesp.和壺菌目的Chytridialessp.在S1_Fu根際土中的豐度與占比都顯著高于S2_Fu。此外，多個(gè)真菌種在連作栽培中豐度有所降低，而在連作障礙發(fā)生的降低程度更為顯著。

3 討 論

土壤根際微生態(tài)系統(tǒng)的失衡是連作障礙的發(fā)生的重要因素，連作栽培導(dǎo)致土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性改變，降低有益微生物數(shù)量，增加土傳病菌數(shù)量，從而引起作物減產(chǎn)[10-12]。采用可培養(yǎng)方法觀察到的微生物不到微生物群落的1 %，無法全面反映微生物的真實(shí)狀況，而本研究采用IlluminaMiSeq 測序技術(shù)，且各樣品測序的稀釋曲線都趨于平緩，各樣品文庫的覆蓋率的值較高，真實(shí)全面地反映了連作障礙發(fā)生對(duì)露地草莓根際中真菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中檢測出共有OTUs較少，根際真菌在門、科、屬、種4個(gè)分類水平的豐度差異大，說明連作栽培以及連作障礙的發(fā)生對(duì)露地草莓根際土壤的真菌種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的影響。Alpha 多樣性指數(shù)結(jié)果表明，非連作栽培露地草莓根際土的真菌豐富度明顯高于連作露地草莓根際土，連作栽培可導(dǎo)致露地草莓根際土中真菌多樣性降低，且發(fā)生連作障礙比未發(fā)生連作障礙的根際土真菌多樣性降低效應(yīng)更為明顯。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接合菌門的被孢霉科(Mortierellaceae)是科分類水平上構(gòu)成露地草莓初果期根際土壤優(yōu)勢群落，該菌主要參與分解土壤中的糖類和簡單多糖物質(zhì)，是參與草莓土壤的養(yǎng)分循環(huán)的主要真菌。從測序過程中的reads種類和數(shù)目結(jié)果中發(fā)現(xiàn)連作栽培導(dǎo)致草莓的致病真菌增多，主要是棒孢擬盤多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)種群顯著提高，由于該菌可引起草莓根腐病、葉斑病[12-13]，嚴(yán)重影響草莓長勢和產(chǎn)量，推測該菌是導(dǎo)致露地草莓連作障礙的重要因素之一，是以后解決連作障礙問題的重要防治靶標(biāo)。此外，沒有發(fā)現(xiàn)灰霉病菌(Botrytiscinerea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鐮刀菌(Fusariumsp.)等其他的草莓致病真菌。

粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)作為一種用于生物防治的拮抗菌，具有拮抗效果好，不產(chǎn)生毒素，可以分泌胞外水解酶(幾丁酶，β-1,3-葡聚糖酶等)分解病原菌細(xì)胞壁，從而抑制病原菌的生長[14]。前期研究還發(fā)現(xiàn)了粘紅酵母所產(chǎn)生的酶能分解了灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的孢子細(xì)胞壁，對(duì)草莓采后灰霉病有較好抑制效果[15]。本研究結(jié)果顯示粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)在連作栽培未發(fā)生連作障礙(S1_Fu)的根際土中豐度是發(fā)生連作障礙(S2_Fu)的根際土中豐度的40多倍，推測粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)是在防止連作障礙發(fā)生上扮演了重要的角色，該菌不僅能有效地利用貧乏營養(yǎng)快速增殖，并且能耐受低溫等不良環(huán)境，拮抗效果好，從而降低了草莓真菌病害發(fā)生率。

無梗囊霉科(Acaulosporaceae)作為叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)的重要成員，是一類非常重要的與植物根系共生的土壤微生物，與植物有密切的互惠共生關(guān)系[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無梗囊霉科真菌Acaulosporaceae sp.在未發(fā)生連作障礙的連作栽培根際土中的豐度與占比都顯著高于發(fā)生連作障礙的連作栽培根際土，由此推斷無梗囊霉科真菌是阻礙露地草莓連作障礙發(fā)生的重要真菌種群，不僅可以促進(jìn)草莓植株對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，還能增強(qiáng)宿主植物的抗逆性和抗病性，進(jìn)而緩解了連作障礙的發(fā)生。

4 小 結(jié)

本文從土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的角度對(duì)3種種植狀態(tài)下的露地草莓根際土壤樣品進(jìn)行測序分析，探究了影響露地草莓健康生長的真菌群落關(guān)鍵因子，對(duì)以往草莓連作障礙的研究進(jìn)行了補(bǔ)充，研究結(jié)果從微生物生態(tài)學(xué)的角度進(jìn)一步表明，連作栽培的問題不僅體現(xiàn)在土壤理化性狀劣變、土壤養(yǎng)分失衡等，連作障礙的發(fā)生還與土壤微生物真菌群落多樣性下降、關(guān)鍵的有益真菌(粘紅酵母、無梗囊霉等)大幅減少，以及病原真菌(棒孢擬盤多毛孢)顯著增多相關(guān)，該結(jié)果為今后改善連作土壤生態(tài)環(huán)境、治理露地草莓連作障礙提供了理論基礎(chǔ)。