許雯雯，龍松華，邱財(cái)生，郭 媛，王 慧，郝冬梅，王玉富

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

【研究意義】甘蔗(Saccharumofficenarum)是世界上主要的糖料及生物能源[1]，我國食糖總量的90 %以上為蔗糖[2],甘蔗燃料乙醇產(chǎn)量約占世界生物燃料乙醇總產(chǎn)量的40 %[3]。如今種植的甘蔗多為異源多倍體或非整倍體，染色體數(shù)在100～150條之間且相差較大[4-6]，一個(gè)基因座上有多個(gè)等位基因，遺傳背景十分復(fù)雜[7-8]。雜交是培育甘蔗新品種及品種改良最重要的方式，在大多數(shù)的甘蔗生產(chǎn)國的糖業(yè)發(fā)展中起著重要的作用。育種親本和種質(zhì)資源的好壞影響著產(chǎn)量相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)，因此了解品種的遺傳多樣性群體結(jié)構(gòu)在育種中起著不可忽視的作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】針對(duì)甘蔗的遺傳多樣性，前人已經(jīng)做了不少研究，Sanghera[9]通過路徑分析方法對(duì)13份材料的產(chǎn)量、質(zhì)量性狀進(jìn)行分析，為亞熱帶地區(qū)提供適宜種植、高糖、高產(chǎn)的優(yōu)良品種。ZAN[10]等人通過AFLP分子標(biāo)記對(duì)來源于不同國家的118份甘蔗種質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，研究表明，各國間的甘蔗種質(zhì)資源具有較高的遺傳相似性，同時(shí)證明了來自于美國的種質(zhì)資源具有更高的遺傳相似性。Ahmah[11]等人的研究表明，利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳(CE)或聚丙烯凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)系統(tǒng)可以高效的對(duì)甘蔗種質(zhì)資源進(jìn)行分子鑒定、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、親本材料篩選。Liu[12]等人利用30對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)不同倍性的崖城割手密進(jìn)行分析，證明了十倍體及八倍體甘蔗群體比九倍體及十二倍體甘蔗群體具有更高的多樣性。Esayas[13]等人利用22對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)埃塞俄比亞當(dāng)?shù)氐?00個(gè)甘蔗品種遺傳多樣性以及群體結(jié)構(gòu)分析，認(rèn)為本地甘蔗種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性，可為開展育種研究提供豐富的材料。Mariana[14]等人利用107對(duì)SSR分子標(biāo)記及136對(duì)AFLP分子標(biāo)記對(duì)63個(gè)甘蔗材料進(jìn)行遺傳分析，證明了SSR標(biāo)記比AFLP標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析更可靠，同時(shí)表明基于貝葉斯法的群體結(jié)構(gòu)分析比主成分分析法和系統(tǒng)聚類法更有效?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綜合特性優(yōu)良的SSR核心引物，對(duì)于甘蔗種質(zhì)資源鑒定、群體劃分、遺傳多樣性分析、品種純度及真實(shí)性檢測(cè)等研究具有重要的價(jià)值，然而不是所有的SSR引物都具有相等的應(yīng)用價(jià)值，因此必須根據(jù)所進(jìn)行的研究需要對(duì)引物進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)，確定其利用價(jià)值，更高效的應(yīng)用于甘蔗材料遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)的研究。另一方面由于通過產(chǎn)量、質(zhì)量性狀、同工酶標(biāo)記等傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)甘蔗品種特性以及遺傳多樣性的鑒定可靠性相對(duì)較低，近年來，分子標(biāo)記技術(shù)以廣泛應(yīng)用于甘蔗品種遺傳多樣性的研究上，如AFLP[10]、PFLP[15]、RAPD[16]等，與其他分子技術(shù)相比，簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)具有高分辨率、高穩(wěn)定性、重復(fù)性好、共顯性遺傳和操作簡單等特點(diǎn)[17-18]，更廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中。但目前依然缺乏對(duì)中國南方甘蔗主產(chǎn)區(qū)資源遺傳背景的了解，采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行南方甘蔗主產(chǎn)區(qū)的栽培品種遺傳多樣性分析及群體結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道還比較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】中國具有豐富的甘蔗種質(zhì)資源及育種親本。本研究通過對(duì)已公布的68對(duì)SSR引物，篩選對(duì)所研究材料具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的核心SSR分子標(biāo)記引物，為后續(xù)開展甘蔗材料遺傳多樣性分析等研究提供理論依據(jù)。運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)95份我國主要栽培材料，進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，旨在揭示我國甘蔗主要育種材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)特征，為甘蔗生產(chǎn)、種質(zhì)資源管理、分子標(biāo)記輔助選擇、育種實(shí)踐以及關(guān)聯(lián)圖譜的構(gòu)建等提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試甘蔗 在貴州、廣西等南方地區(qū)收集具有代表性的19個(gè)甘蔗品種，同一品種在主栽區(qū)不同地理位置分別取5株樣品，所有材料于2016年4-11月和2017年4-11月連續(xù)2個(gè)生長季種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所長沙創(chuàng)新試驗(yàn)基地，每個(gè)品種種2行，行長6 m，行間距1.5 m。于分蘗期采嫩葉片，共95份材料于-70 ℃保存?zhèn)溆?。材料編?hào)、品種名稱、育種單位如表1所示。

1.1.2 SSR引物 所有的68對(duì)甘蔗SSR引物均根據(jù)已有的研究基礎(chǔ)，引自相關(guān)文獻(xiàn)[19-22]。SSR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 95份供試材料的名稱及地理來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取甘蔗幼嫩葉片基因組DNA，稀釋至50 ng/μl工作液，采用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，100 V電壓，電泳30 min,結(jié)果用紫外線凝膠成像儀檢測(cè)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物檢測(cè) PCR擴(kuò)增試驗(yàn)采用北京天根公司生產(chǎn)的2×TaqPCR MasterMix(KT201)產(chǎn)品，包括TaqDNA聚合酶0.1 U/μl、dNTPS(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)500 μM、Tris-HCl(pH 8.3) 20 mM、KCl 100 mM、MgCl23 mM、2×PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑?？焖俸啽恪㈧`敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度的減少人為誤差。

PCR反應(yīng)體系(20 μl)：2×TaqPCR MasterMix 10 μl，模板DNA 1 μg，前引物1 μl，后引物1μl，ddH2O補(bǔ)至7 μl。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共 30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 5 min，在 Biometre 公司 T-Gradient Thermoblock 型號(hào) PCR 擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物 4 ℃保存或進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，EB替代物染色，紫外凝膠成像儀檢測(cè)結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)94 ℃變性后在8.0 %的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，電泳儀北京君意公司產(chǎn)品，緩沖液為1×TBE。電壓為180 W，電泳時(shí)間為2.5 h。卸膠后，采用10 %乙醇，1 %冰乙酸固定10 min，去離子水漂洗1 min；0.1 %的硝酸銀輕搖染色10 min，去離子水漂洗2次；最后用提前預(yù)冷的1.5 %NaOH和1 %甲醛的顯色液顯影，在紫外凝膠成像儀觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 聚類分析 SSR擴(kuò)增譜帶在同一位點(diǎn)上具有相同遷移率的條帶記為1，無帶記為0，將甘蔗基因組特定位點(diǎn)的多態(tài)性數(shù)字化，進(jìn)行二維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[23-25]，并統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。

1.3.2 群體結(jié)構(gòu)分析 依據(jù)Hubize等[26]的方法，利用STRUCTURE 2.3.4數(shù)據(jù)處理軟件，進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分，設(shè)置分析群體數(shù)K(the true number of clusters)為1～10，每個(gè)參數(shù)運(yùn)行10 次，每次運(yùn)行的不作數(shù)迭代(Length of burn-in time)設(shè)置為10 000，重復(fù)次數(shù)為10 000。計(jì)算結(jié)果用Structure Harvester網(wǎng)頁工具(http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester)分析[27]，根據(jù)lnP(D)或者ΔK的值確定群體的亞群數(shù)，根據(jù)似然值最大的運(yùn)行結(jié)果劃分亞群并繪制出模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

取部分已提取好的甘蔗DNA，各1 μl，與1 μl的6-Loading Buffer 混勻，用1 %的瓊脂糖凝膠，100V電壓，電泳30 min，結(jié)果用紫外凝膠成像儀檢測(cè)。

圖1 部分樣品DNA電泳圖Fig.1 Some samples of DNA electrophoresis figure

從圖1可以看出，所提取的甘蔗DNA，質(zhì)量完好，主帶唯一，無拖尾和彌散，能夠滿足SSR標(biāo)記要求。

2.2 SSR引物篩選

由表2顯示，利用68對(duì)SSR引物對(duì)19份不同品種的甘蔗材料提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，綜合比較各引物的多態(tài)性信息量(PIC)、帶型清晰度、穩(wěn)定性和重復(fù)性高低等，最終篩選出21對(duì)表現(xiàn)良好的SSR引物。由表3顯示，篩選出的21對(duì)引物在19個(gè)甘蔗品種中共檢測(cè)出440條譜帶，多態(tài)性譜帶數(shù)為422個(gè)，多態(tài)率達(dá)95.90 %，條帶大小分布在100～500 bp之間。其中引物ZP22、ZP30擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，各擴(kuò)增出29條，引物ZP25擴(kuò)增條帶數(shù)最少為12條。21對(duì)引物的SSR多態(tài)性信息量(PIC)變化為0.7855～0.9279，平均值為0.8664。從總體來看，19個(gè)甘蔗品種在21對(duì)SSR位點(diǎn)上表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

表2 68對(duì)SSR引物名稱和序列信息

表3 21對(duì)甘蔗引物的SSR檢測(cè)

2.3 聚類分析

2.3.1 基于SSR分子標(biāo)記的遺傳距離 通過Powermarker v3.25軟件計(jì)算19個(gè)群體于SSR分子標(biāo)記的Nei’72遺傳距離為0.2024～0.7262，平均Nei’72遺傳距離為0.5779，同一品種的不同個(gè)體間有一定的遺傳差異，但是遺傳距離較群體間的遺傳距離小。

2.3.2 基于SSR分子標(biāo)記的聚類分析 從圖2可以看到，不同地理位置的同一品種基本聚在一起，說明群體內(nèi)個(gè)體間遺傳相似性比較低。如圖3所示，羅漢蔗群體最先與其他材料形成的大類群分開，表明羅漢蔗與其他材料表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，其次是桂熱2號(hào)與廣東黃皮。查找相關(guān)資料顯示黔蔗08-526與黔蔗08-536均是由ROC10與崖城84/125雜交獲得，而從圖中可以看到黔蔗08-526與黔蔗08-536聚在一起，說明在選中的19份甘蔗材料中其親緣關(guān)系較近。在遺傳距離0.3處，19個(gè)群體可以分成4個(gè)類群。其中，類群Ⅰ包括羅漢蔗一個(gè)群體；類群Ⅱ包括福農(nóng)38、黔蔗08-536、新臺(tái)糖22、內(nèi)江97-113、臺(tái)糖、黔蔗06-156、黔蔗06-126、黔糖4號(hào)、黔蔗08-558、黔蔗06-212、黔蔗08-526，共11個(gè)群體；類群Ⅲ只含有桂熱2號(hào)一個(gè)群體，類群Ⅳ包括黔蔗08-688、桂果糖1號(hào)、黔糖3號(hào)、黔糖5號(hào)、湖南本地品種、廣東黃皮，共7個(gè)群體。在遺傳距離為0.26處，類群Ⅱ、Ⅲ又可以分別劃分為3、4個(gè)亞類群。其中，部分黔蔗品種分別聚集分布在同一類群，如黔蔗06-156、黔蔗06-126、黔糖4號(hào)分布在同一個(gè)小亞群，黔蔗08-558、黔蔗08-536、黔蔗08-526分布在同一個(gè)小亞群，但是也有個(gè)別的黔蔗系列品種分布在其他的類群。

圖2 95個(gè)甘蔗個(gè)體基于Nei’1973遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖Fig.2 UPMGA dendrogram based on Nei’1973 genetic distance for sugarcane

圖3 19個(gè)甘蔗群體基于Nei’1973遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖Fig.3 MGA dendrogram based on Nei’1973 genetic distance for sugarcane

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

對(duì)19個(gè)甘蔗群體，共95個(gè)個(gè)體，進(jìn)行依據(jù)SSR分子標(biāo)記的遺傳結(jié)構(gòu)分析。參照Evanno等[28]的方法，ΔK取得最大值各群體內(nèi)甘蔗材料的相似性最大。由圖4顯示，當(dāng)K= 6時(shí)，ΔK出現(xiàn)明顯的峰值，個(gè)群體內(nèi)甘蔗相似性最大，所以確定群體的數(shù)目為6。如圖5(見封三)所示，190份甘蔗個(gè)體可被分成6個(gè)亞群，這6個(gè)亞群分別包含了20、10、15、20、25、5份材料。黃色所占比例較多的群體為1個(gè)亞群即亞群Ⅰ，含有4個(gè)群體分別為TZ01、GZ01、TZ02、TZ10，綠色所代表的亞群Ⅱ含有2個(gè)群體為TZ07、TZ08，粉色亞群Ⅲ含有3個(gè)群體為TZ11、GZ06、GZ08，橙色亞群Ⅳ含有4個(gè)亞群分別為GZ07、GZ03、GZ04、GZ05，紅色亞群Ⅴ含有5個(gè)亞群分別為TZ04、TZ06、TZ05、TZ03、TZ09，藍(lán)紫色的亞群Ⅵ只含有1個(gè)群體為GZ02。

3 討 論

PIC值是核心引物篩選的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)從已公布的68對(duì)SSR引物中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的21對(duì)核心引物，平均PIC值為0.8664，高于前人Amaresh[29]公布的PIC值0.66、0.77，以及Hu[30]等公布的0.64，但是低于前人Liu[31]等人報(bào)道的平均PIC值0.9724,主要因?yàn)閷?duì)引物多態(tài)性高低的評(píng)估受所利用材料類型及材料范圍的影響較大[32-33]。此外引物ZP22、ZP30擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，各為29條，PIC值分別為0.8531、0.9052，引物ZP25擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少為12條，但其PIC值為0.8680高于ZP22，同時(shí)引物ZP40擴(kuò)增的條帶數(shù)為15，少于引物ZP22、ZP30擴(kuò)增的條帶數(shù)，但是其PIC值較高為0.9126，這些SSR分子標(biāo)記具有較高的多態(tài)性及較多的等位基因數(shù)，表明在甘蔗品種間親緣關(guān)系分析及指紋識(shí)別方面具有重要作用，但是SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增等位基因的數(shù)目不能直接反映其鑒別甘蔗品種的能力，這與Hameed[34]報(bào)道的一致。篩選獲得的21對(duì)引物對(duì)本試驗(yàn)所分析的材料表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，但是對(duì)于其他材料或隨著品種增加以及品種來源地的豐富，這些引物是否同樣具有較好的鑒別能力還需要進(jìn)一步的研究。

圖4 K值曲線圖Fig.4 Curve diagram of K value

遺傳距離及遺傳相似通常是對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)的2種指標(biāo)。材料遺傳多樣性高低一定程度上決定了新種質(zhì)開發(fā)與品種培育的成效，對(duì)于指導(dǎo)資源的利用和提高品種選育效率具有重要意義。本研究結(jié)果中19個(gè)群體的遺傳距離為0.2024～0.7262，平均遺傳距離是0.5779，高于前人Esayas[13]、Sharma[35]等人報(bào)道的遺傳距離，本試驗(yàn)所選取的研究材料遺傳多樣性較豐富，可能是由于所選擇的材料包含豐富的親本類型，同時(shí)所選材料地理分布差異較大，能夠較好的反映我國目前主要甘蔗栽培品種的遺傳多樣性?；赟SR分子標(biāo)記的聚類分析表明，亞群的劃分與品種地理來源地存在一定的聯(lián)系，如黔蔗08-558與黔蔗08-536遺傳距離較近、黔糖3號(hào)與黔糖5號(hào)遺傳距離較近，但是兩組間的遺傳距離相差較大，分在不同的組里，這可能與雜交親本的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有一定的關(guān)系，與Giovanni[36]、Yves[37]等報(bào)道的一致。

通過聚類分析可以初步對(duì)群體進(jìn)行亞群的劃分，但是要想獲得亞群更合理的劃分則需要群體結(jié)構(gòu)分析完成，為了進(jìn)一步對(duì)19個(gè)群體研究，采用群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。本研究中，主要栽培地區(qū)甘蔗品種的群體結(jié)構(gòu)分析與聚類分析結(jié)果有一定的相似性，但是具體的亞群劃分存在差異，與Ren等[38]在花生群體結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性的報(bào)道一致。不同地區(qū)同一品種的個(gè)體間存在較少的差異，可能與甘蔗生產(chǎn)上多采取無性繁殖保育的方式有關(guān)[39]，也可能與樣品采集的地理位置相差不大有一定的關(guān)系，使得個(gè)體間的基因型保持相對(duì)一致，但是不同品種的群體間遺傳差異較大，本試驗(yàn)將19個(gè)群體劃分為6個(gè)亞群，且混合亞群所占的比例較多，表明19個(gè)群體間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本研究結(jié)果與Yong wen等[40]關(guān)于甘蔗品種的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道和 Yves等[37]關(guān)于玉米遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析的報(bào)道一致。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)已公布的68對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得的21對(duì)SSR引物能夠很好的區(qū)分本研究的各個(gè)材料，同時(shí)供試材料基因組水平的遺傳多樣性較豐富，可為上述親本資源的利用奠定良好的基礎(chǔ)，并為今后研究中的親本選擇和組合等方面提供重要參考。