葉春秀，趙增強(qiáng)，張國麗，于 航，莊振剛，謝宗銘*

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)所/作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000)

【研究意義】蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是生物體中普遍存在的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，它幾乎涉及所有的生理和病理過程。如光合作用、基因表達(dá)、細(xì)胞的生長發(fā)育、糖代謝、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、甚至癌變等等。據(jù)估計(jì)，真核生物1 %～3 %的基因編碼蛋白激酶，而植物中可能有2 %～3 %的基因編碼蛋白激酶，這些蛋白激酶參與了環(huán)境刺激和植物激素等多種信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的傳遞[1-3]。雖然植物蛋白激酶的研究發(fā)展迅，但仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于動(dòng)物和人類，許多蛋白激酶的生物學(xué)功能還不清楚，但也有所進(jìn)展，近來在植物中也發(fā)現(xiàn)了分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-actived Protein Kinase, MAPK)的相似蛋白，MAPK(ERKs)是一族胞漿內(nèi)廣泛分布的含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)激酶[4-9]。MAPK 受雙重磷酸化，是真核蛋白激酶的一種特殊分類，能在絲氨酸、蘇氨酶、酪氨酸殘基上磷酸化。在MAPKs 的活化環(huán)中激活的磷酸化發(fā)生在保守的Thy-X-Tyr 基元中。MAPK 通過使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達(dá)水平。MAPK 是真核信號(hào)傳遞中的關(guān)鍵因素，MAPKs 可能參與各種發(fā)育或脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)。有研究表明：一些植物生長因子如植物生長素、乙烯可以活化MAPK等。另外，研究表明小麥上TaLRK蛋白激酶家族基因能夠參與小麥抗白粉病反應(yīng)[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甜瓜作為新疆的特色水果之一，其蛋白激酶的研究將為甜瓜的基礎(chǔ)代謝、抗逆和抗病蟲害的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，并且目前甜瓜蛋白激酶的研究還屬于零星研究，遠(yuǎn)未能構(gòu)成完整的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本項(xiàng)目組根據(jù)NCBI上已報(bào)道的其它物種的蛋白激酶類基因，比對相對保守的序列，設(shè)計(jì)相關(guān)的引物，采用RT-PCR方法獲得了CmPKC的部分序列，根據(jù)部分序列的測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，分別采用3’ RACE和5’ RACE技術(shù)獲得了該基因的全長序列。【擬解決的關(guān)鍵問題】該基因的克隆與表達(dá)分析將為進(jìn)一步研究蛋白激酶類基因在抗病性調(diào)控過程中所起的作用及下一步構(gòu)建植物表達(dá)載體及基因沉默奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗白粉病與不抗白粉病的甜瓜材料由新疆兵團(tuán)第六師科學(xué)研究所提供，種植于新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室。

RNA Trizol提取試劑盒、TaqDNA 聚合酶、DNA 回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記、T4DNA連接酶購自天根公司；3’及5’-RACE試劑盒、克隆載體 pMD 19-T Vector購自 TaKaRa 公司；熒光定量試劑盒購自全士金公司；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 總RNA的提取采用天根Trizol試劑盒，根據(jù)操作說明完成。材料為2對真葉期的白粉病抗病與不抗病的甜瓜幼苗及接菌0，1，5，9，24 h不同抗性的材料，液氮速凍，-80 ℃保存用于RNA的提取。

1.2.2 cDNA的合成及基因部分序列的克隆 參照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA第一鏈，根據(jù)相對保守序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行部分序列的擴(kuò)增。

1.2.3 3’ RACE和5’ RACE 參照TARAKA試劑盒說明書，以Total RNA為模板，使用3′ RACE adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成lstStrand cDNA，使用上游外側(cè)特異性引物(GSP1，表3)和3′ RACE Outer Primer進(jìn)行1stPCR反應(yīng)，再使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物(GSP2)和3′ RACE Inner Primer進(jìn)行2ndPCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物連接PMD9-T進(jìn)行TA克?。暨x陽性克隆，送給公司測序。

5’RACE。使用Alkaline Phosphatas去掉Total RNA 中裸露的5’磷酸基團(tuán)． 用Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉mRNA 的5’帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。使用T4RNALigase將5’RACE Adaptor連接到去帽后的mRNA 上，然后以此mRNA 為模板，使用Reverse Transcrip-tase M-MLV (RNase H.)，Random 9 mers進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用下游外側(cè)特異性引物GSP3和5’ RACE Outer Primer進(jìn)行Outer PCR反應(yīng)，再使用下游內(nèi)側(cè)特異性引物GSP4和5′RACE Inner Primer進(jìn)行Inner PCR反應(yīng) PCR產(chǎn)物連接PMD19-T，TA克隆，挑選陽性克隆，送公司測序。

1.2.4 熒光定量及半定量檢測 利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的方法檢測CmPKC基因在不同抗性甜瓜材料及不同接種時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量。上游引物序列為：5’-CTTGCCTTCTTTGCTTGG-3’；下游引物序列為：5’-TCTTCTTGGCGGAGTGGT-3’。用PR0961402 36實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系如下：10 μl 2× SYBR?Premix ExTaqTM，正反向引物均為 0.4 μl，cDNA 模板 2 μl；加 ddH2O至 20 μl。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)，實(shí)時(shí) PCR反應(yīng)以甜瓜18S rDNA為內(nèi)參，每個(gè)反應(yīng)重復(fù) 3 次。

1.2.5 煙草轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證 采用常規(guī)的葉盤法及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行煙草的轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化煙草植株后進(jìn)行陽性檢測，檢測引物采用部分基因序列引物和載體NPTII引物進(jìn)行，將同時(shí)擴(kuò)增出條帶的植株定位陽性植株，進(jìn)行移栽，收獲種子保存，用于后期實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜RNA的提取

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)甜瓜葉片特性采用天根Trizol試劑盒進(jìn)行RNA的提取，參照說明書進(jìn)行相應(yīng)的操作，采用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行RNA質(zhì)量與濃度的檢測，檢測結(jié)果表明提取的RNA濃度與質(zhì)量較好，能夠滿足后期的實(shí)驗(yàn)需要(圖1)。

圖1 RNA提取質(zhì)量檢測Fig.1 Quality of RNA of Cucumis melon L.

2.2 甜瓜CmPKC基因中間片段的擴(kuò)增

以不同抗性甜瓜材料的cDNA為模板，以中間部分序列引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)在約2600 bp處有一條亮帶(圖2)。將此片段進(jìn)行回收純化，連接PMD19-T Vector 連接，轉(zhuǎn)化檢測后進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示該片段的大小為2500 bp，與其他植物的類似蛋白激酶類基因同源性較高。

2.3 甜瓜CmPKC基因3’-RACE和5’-RACE

通過3’RACE和5’RA CE分別獲得了約500bp的3’端片段和400 bp的5’端片段(圖3)。測序結(jié)果表明，其序列前后分別能與CmPKC基因中間序列前后吻合，說明獲得了甜瓜CmPKC基因的3’端和5’端，然后將中間片段，3’端和5’端片段拼接，設(shè)計(jì)全長引物進(jìn)行擴(kuò)增，最終獲得的CmPKC基因長約為2914 bp，開放閱讀框?yàn)?493 bp，編碼831個(gè)氨基酸(圖3)。

圖2 CmPXC基因中間部分序列擴(kuò)增圖譜Fig.2 PCR amplification of CmPKC of Cucumis melon L.

2.4 CmPKC蛋白的氨基酸序列分析、比對與進(jìn)化樹的構(gòu)建

如圖4所示，利用NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫對CmPKC的同源基因氨基酸序列進(jìn)行比對和搜索，結(jié)果顯示，CmPKC與已報(bào)道的香瓜蛋白激酶不同剪接體，黃瓜、楊樹、歐洲油菜、羽衣甘藍(lán)、蕪菁等植物的蛋白激酶類似基因氨基酸具有較高的同源性，其中與甜瓜G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase 剪接體2同源性最高，達(dá)到88 %。

A.3′-RACE;B.3′-RACE;C.Full length圖3 甜瓜CmPKC基因3’ RACE，5’ RACE和全長序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of 3’, 5’end and full length of CmPKC gene

The amino acid sequences used to build up the phylogenic tree were: Cucumis melo transcript variant X2(XM008463932.2); Cucumis melo transcript variant X1(XM017047356.1); Cucumis melo transcript variant X3(XM017047360.1); Cucumis melo transcript variant X4(XM017047361.1); Cucumis sativus mRNA (XM011661496.1); Cucumis melo mRNA (XM008462843.2); Populus euphratica(XM011014277.1); Brassica napus RKS1(XM013839662.1); Brassica napus SD2-5(XM013864066.1); Brassica pleracea SD2-5(XM013738810.1); Brassica rapa SD2-5(XR629743.1)圖4 CmPXC與同源基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenic tree of CmPKC and protein coded by by its homologous genes

A:抗性材料接菌后相對表達(dá)量；B：感病材料接菌后相對表達(dá)量A:Resistance material；B: Susceptibility material圖5 CmPKC基因在甜瓜白粉病抗性及感病材料上接菌后的相對表達(dá)量Fig.5 Expression quality of CmPKC in different material of Cucumis melon L.

2.5 甜瓜CmPKC基因在不同抗性材料上的表達(dá)分析

利用甜瓜的18S作為內(nèi)參，對CmPKC基因在不同抗性材料上進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明在抗性材料上，接菌9 h后該基因的表達(dá)量最高(圖5A)，而在感病材料上接菌5 h后該基因的表達(dá)量最高(圖5B)，與現(xiàn)有報(bào)道的一個(gè)與甜瓜感病相關(guān)MLO家族基因表達(dá)量變化規(guī)律一致，但表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及該家族基因，說明所獲得的基因可能與甜瓜白粉病的感病相關(guān)，且屬于早期應(yīng)答基因類型；通過對不同接菌時(shí)間的抗病與感病材料CmPKC基因轉(zhuǎn)錄水平定量分析顯示該基因在甜瓜白粉病上的抗性機(jī)制類似于MLO基因在植物上對白粉病的抗性機(jī)制，在抗性材料上在接菌24 h前出現(xiàn)的表達(dá)高峰可能與乳突反應(yīng)的發(fā)生有一定的聯(lián)系,當(dāng)完成乳突反應(yīng)后,病原菌即被阻隔在細(xì)胞之外直至失去侵染活性,隨即表達(dá)量下降。而感病品種的表達(dá)量在24 h 后開始上升，且高峰出現(xiàn)在72 h。由于24 h 內(nèi)是白粉菌完成侵入的關(guān)鍵時(shí)期，在抗病品種24 h前出現(xiàn)了表達(dá)高峰，推測抗病材料中CmPKC基因可能直接參與了抗病反應(yīng)。而感病品種由于峰值反應(yīng)的延遲，錯(cuò)過了抵抗病原菌侵入的最佳時(shí)機(jī)，導(dǎo)致了植物感病(圖6)。

2.6 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

提取轉(zhuǎn)化煙草及野生煙草植株的基因組DNA，采用基因部分序列引物及NPTII基因引物分別進(jìn)行PCR檢測，最終選擇能夠同時(shí)擴(kuò)增出目的基因和NPTII基因的植株定位陽性植株(圖7)，經(jīng)過后期觀察，該基因在起抗逆作用同時(shí)還具有促進(jìn)煙草開花的功能，其較野生植株開花期提前很多(圖8)且抗逆性有所增加，其在抗病過程中所起的作用有待深入分析和研究。

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草植株目的基因及NPTII鑒定Fig.7 PCR amplification of CmPXC and NPTII

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草提前開花植株與對照植株Fig.8 Comparation of standard and early flowering plants

3 討 論

在植物體內(nèi)，存在著大量參與植物組織形成和器官發(fā)育的激酶。 擬南芥中的ERECTA基因編碼含LRR 的激酶，其與器官的形成及營養(yǎng)生長有關(guān)[10]；HAESA也是一種含LRR 的激酶，參與了花組織器官的脫落[11]；CLAVATA與根和花的分生組織中細(xì)胞的增殖和組織形成有密切的關(guān)系[12]；另外，WAK(wall2associated receptor2like kinase) 通過細(xì)胞的伸長生長，調(diào)控側(cè)根的生長發(fā)育[13]；AtSERK1編碼一種參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的類受體蛋白激酶；SCM和根的表皮細(xì)胞發(fā)育有關(guān)[14-15]。矮牽牛中的PRK1在花粉粒中特異表達(dá)，在小孢子減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育和授粉中起信號(hào)傳遞作用，保證花粉粒正常發(fā)育和萌發(fā)[16]；玉米的Crinkly4 基因編碼的激酶參與調(diào)控葉表皮細(xì)胞和胚乳中糊粉細(xì)胞的分化[17]。

另外，已鑒定的抗病基因中有多個(gè)類受體激酶，對該類抗病基因的克隆及其序列分析和功能的研究，促進(jìn)了人們對激酶在植物抗病中作用的認(rèn)識(shí)。水稻抗白葉枯病基因Xa21 和Xa26都編碼一個(gè)具有胞外LRR 區(qū)的絲/蘇氨酸激酶，LRR 區(qū)參與蛋白質(zhì)相互作用[18-19]。水稻抗稻瘟病基因Pi2d2編碼的蛋白質(zhì)胞外是B 凝集素(B2lectin) 結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)是絲/蘇氨酸激酶區(qū)[20]。Martin 等從番茄中克隆的抗丁香假單孢桿菌(Pseudomonassyingaepv.tomato) 的基因Pto，編碼一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶[21]。 擬南芥的FLS2 基因，編碼含LRR 結(jié)構(gòu)域的類受體激酶，在植物抗病和病原菌識(shí)別中起重要作用。大麥的Rpg1基因編碼的激酶抗銹病[22]。小麥抗葉銹病基因Lrk10 編碼胞外含有S結(jié)構(gòu)域的受體蛋白激酶[23-24]。

本文通過同源基因克隆，步移和RACE法成功克隆出CmPKC基因全長，其開放閱讀框?yàn)?493 bp，編碼831個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的甜瓜蛋白激酶不同剪接體，黃瓜、楊樹、歐洲油菜、羽衣甘藍(lán)、蕪菁等植物[8]的蛋白激酶類似基因氨基酸具有較高的同源性，其中與甜瓜G-type lectin S-receptor-like serine/threonine-protein kinase 剪接體2同源性最高，達(dá)到93 %。對不同抗性的甜瓜材料進(jìn)行白粉菌接種后，半定量和熒光定量分析結(jié)果顯示該基因與目前報(bào)道的甜瓜MLO基因家族表達(dá)量在不同抗性材料上的變化趨勢一致，推測該基因在甜瓜白粉病上的抗性機(jī)制可能類似于MLO基因在植物上對白粉病的抗性機(jī)制，且屬于早期應(yīng)答基因，即在抗性材料上在接菌24 h前出現(xiàn)的表達(dá)高峰可能與峰值反應(yīng)的發(fā)生有一定的聯(lián)系，當(dāng)完成峰值反應(yīng)后，在表面產(chǎn)生凸起，病原菌即被阻隔在細(xì)胞之外直至失去侵染活性，隨即表達(dá)量下降。而感病品種的表達(dá)量在24 h 后開始上升，且峰值出現(xiàn)在72 h。由于植物24 h內(nèi)是白粉菌完成侵入的關(guān)鍵時(shí)期，在抗病品種24 h前就出現(xiàn)了表達(dá)高峰，推測抗病材料中的CmPKC基因可能直接參與了抗病反應(yīng)，而感病品種由于峰值反應(yīng)的延遲，錯(cuò)過了抵抗病原菌侵入的最佳時(shí)機(jī)，導(dǎo)致了甜瓜感病，具體調(diào)控途徑有待于進(jìn)一步分析。轉(zhuǎn)基因煙草鑒定顯示該基因可能還參與植株的生長發(fā)育過程，還需后期經(jīng)過進(jìn)一步的鑒定確定其具體參與的調(diào)控路徑。