陳郁，龔亮，李海波，羅勇軍

高原地區(qū)由于其特殊的地理環(huán)境，以及近年來的建設(shè)發(fā)展和交通設(shè)施的逐漸完善，吸引著越來越多的人群從平原進(jìn)入高原從事相關(guān)活動(dòng)，其中絕大部分為短期旅游者[1]。高原地區(qū)空氣稀薄、氧分壓低，是進(jìn)入高原的平原人群發(fā)生急性高原反應(yīng)最主要的原因，但是其導(dǎo)致?lián)p傷的具體機(jī)制仍未完全闡明[2-4]。氧化應(yīng)激和自由基代謝異常是低氧引起損傷的重要因素，故適度應(yīng)用抗氧化劑是防治低氧損傷的重要考慮方向[5]。在眾多的抗氧化劑中，氫具有極強(qiáng)的還原性，能夠選擇性地與氧自由基結(jié)合而減弱其作用，在抗氧化應(yīng)激、對抗自由基代謝和抗炎方面發(fā)揮著重要作用，對機(jī)體重要器官具有顯著的保護(hù)效應(yīng)[6]。為評估氫在急性缺氧過程中的抗氧化作用，本研究將大鼠暴露在模擬海拔5000m的高原環(huán)境中，構(gòu)建大鼠急性缺氧模型，探討不同劑量氫氣菌群制劑對急性缺氧大鼠重要器官氧化應(yīng)激指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響，為應(yīng)用氫氣菌群及氫氣相關(guān)制品預(yù)防和治療急性高原病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10～12周齡健康雄性SD大鼠共40只，體重200～220g，購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系動(dòng)物房，所有動(dòng)物均自由攝食、飲水，控制室溫在20～24℃。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物及主要試劑、儀器 氫氣菌群制劑購自日本D&D TRINITY公司(http://ddtrinitylab.shopselect.net/items/3183023)。丙二醛(malonaldehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。血漿腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)檢測采用ELISA試劑盒完成(武漢博士德生物工程有限公司)。Multiskan GO全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。動(dòng)物模型制備采用高原環(huán)境模擬艙(DYC-2842T型低壓氧艙)，由貴航集團(tuán)風(fēng)雷機(jī)械廠建造。

1.3 動(dòng)物模型制備 將40只SD大鼠隨機(jī)分為平原生理鹽水(normoxic saline，NS)組、高原生理鹽水(high-altitude saline，HS)組、高原低劑量(highaltitude low-dose，HL)組、高原中劑量(high-altitude medium-dose，HM)組、高原高劑量(high-altitude high-dose，HH)組，每組8只。低劑量組、中劑量組和高劑量組的給藥劑量分別為10、20、40mg/(kg·d)，于每天上午固定時(shí)間灌胃給藥，1次/d。高原組的動(dòng)物在海拔4000m灌胃給藥、換水、食物及新鮮干凈墊料，在30min內(nèi)完成，給藥完畢后動(dòng)物上升至海拔5000m，連續(xù)3d，其中HS組每只大鼠灌胃2ml生理鹽水。NS組每只大鼠亦灌胃2ml生理鹽水，不進(jìn)入低壓氧艙。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 第3次給藥后1d，在模擬海拔4000m處，將所有高原組動(dòng)物處死取材。采用14%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，劑量以1ml/100g計(jì)。取材時(shí)剪開胸腔，用注射器心臟采血，注意防止大出血導(dǎo)致采血失敗。取血完畢后將血液轉(zhuǎn)移至EDTA鈉抗凝管中，3000r/min離心10min，留取血漿，分裝凍存，–80℃?zhèn)溆?。分別獲取肝、肺及心臟組織，轉(zhuǎn)移至凍存管中，于液氮中凍存，再轉(zhuǎn)移至–80℃?zhèn)溆?。NS組取材在高原組取材后完成，樣品處理同高原組。

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測 血漿在室溫解凍，采用ELISA法檢測血漿中的TNF-α含量，單位為pg/ml。采用比色法測定肝、肺、心肌組織中的MDA、CAT、SOD和GSH含量。將肝、肺、心肌組織4℃解凍后，每個(gè)標(biāo)本剪取0.1g的組織，放入2ml的EP管中，再加入0.9ml的生理鹽水。采用預(yù)冷的眼科剪剪碎組織，勻漿機(jī)勻漿結(jié)束后置于冰上。待全部樣品勻漿完成后，以2500r/min的速度于4℃條件下離心10min，制備10%組織勻漿液置于4℃?zhèn)溆?。采用BCA法測定組織勻漿液蛋白含量。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對每個(gè)器官的每個(gè)檢測指標(biāo)均測定了最佳檢測濃度，故在獲取10%的組織勻漿液后，采用生理鹽水稀釋至最佳濃度，分裝置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較時(shí)方差齊采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane'T2分析。均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 給藥后大鼠血漿TNF-α含量變化 在模擬海拔5000m的低氧環(huán)境暴露3d后，與NS組[(36.24±3.92)pg/ml]相比，高原各組的TNF-α含量[HS組為(39.89±5.38)pg/ml，HL組為(32.59±1.97)pg/ml，HM組為(39.89±5.38)pg/ml，HH組為(35.43±2.09)pg/ml]無明顯差異；與HS組相比，HL組的TNF-α含量明顯下降(P＜0.01)。

2.2 肝、肺、心肌組織各氧化應(yīng)激指標(biāo)的最佳測量濃度 由于不同組織的MDA、CAT、SOD及GSH含量不同，為保證最佳檢測效果，在正式檢測之前，先摸索了不同組織不同指標(biāo)的最佳檢測濃度，結(jié)果見表1。在正式檢測前，將勻漿組織上清用生理鹽水稀釋至目標(biāo)濃度，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 急性缺氧大鼠各組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的最佳檢測濃度(%)Tab.1 Optimal concentrations of MDA, SOD, CAT and GSH of different tissues in acute hypoxia rats (%)

2.3 給藥后大鼠肝組織MDA、CAT、SOD和GSH含量變化 與NS組相比，HS組及高原各藥物組大鼠肝組織MDA含量無明顯變化，與HS組相比，高原各藥物組大鼠肝組織DMA含量無明顯變化，提示氫氣菌群制劑在降低肝組織MDA含量方面無明顯效果。與NS組相比，HS組、HL組及HH組大鼠肝組織CAT含量均明顯下降(P＜0.01)，而與HS組相比，高原各藥物組大鼠肝組織CAT含量均無明顯變化，提示氫氣菌群制劑在提高肝組織CAT含量方面無明顯效果。NS組、HS組及高原各藥物組大鼠肝組織SOD含量比較均無明顯差異，提示氫氣菌群制劑對改善肝組織SOD無明顯效果。與NS組相比，HS組及高原各藥物組大鼠肝組織GSH含量明顯下降(P＜0.01)，與HS組相比，HL組和HH組大鼠肝組織GSH含量均明顯升高(P＜0.05)，HL組、HM組和HH組之間無明顯差異，提示低、中、高劑量的菌群制劑均可改善肝組織中GSH代謝，而高劑量的菌群制劑效果較好(表2)。

表2 急性缺氧大鼠各組給藥后肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=8)Tab.2 Changes of indicators in liver tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

表2 急性缺氧大鼠各組給藥后肝組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=8)Tab.2 Changes of indicators in liver tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

MDA. Malonaldehyde; CAT. Catalase; SOD. Superoxide dismutase; GSH. Glutathione; NS. Normoxic saline group; HS. High altitude saline group, HL. High altitude low-dose group, HM. High altitude medium-dose group; HH. High altitude high-dose group. (1)P＜0.01 compared with NS group; (2)P＜0.01, (3)P＜0.05 compared with HS group

GSH(μmol/g prot)NS 0.36±0.04 0.88±0.18 0.76±0.14 43.63±8.90 HS 0.44±0.13 0.62±0.10(1)0.69±0.10 22.89±3.06(1)HL 0.52±0.16 0.56±0.18(1)0.68±0.22 29.65±6.00(1)(3)HM 0.43±0.08 0.65±0.26 0.58±0.12 27.63±3.64(1)HH 0.46±0.08 0.55±0.11(1)0.63±0.07 31.09±5.06(1)(3)Group MDA(nmol/mg prot)CAT(U/ml)SOD(U/mg prot)

2.4 給藥后大鼠肺組織MDA、CAT、SOD和GSH含量變化 與NS組相比，HS組大鼠肺組織MDA含量明顯增加(P＜0.01)，與HS組相比，HL組及HM組大鼠肺組織MDA含量明顯下降(P＜0.05)，HL組則明顯低于HH組(P＜0.01)而明顯高于HM組(P＜0.01)，HM組明顯低于HH組(P＜0.01)，提示在肺組織中，低劑量和中劑量的菌群制劑均有較好的抑制脂質(zhì)過氧化的效果。與NS組相比，HS組大鼠肺組織CAT含量無明顯變化，與HS組相比，HL、HM和HH組大鼠肺組織CAT含量明顯上升(P＜0.01)，HL、HM和HH組之間CAT含量無明顯差異，提示氫氣菌群制劑能夠改善大鼠肺組織的CAT含量。與NS組相比，HS組與高原各藥物組大鼠肺組織SOD含量均無明顯變化，與HS組相比，HM組大鼠肺組織SOD含量明顯增加(P＜0.01)，HM組明顯高于HL組和HH組(P＜0.01)，HH組與HL組比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑能夠提高缺氧大鼠肺組織SOD的含量，且中等劑量效果最佳。與NS組相比，HS組大鼠肺組織GSH含量明顯下降(P＜0.05)，而高原各藥物組無明顯變化，與HS組相比，HM組大鼠肺組織GSH含量明顯升高(P＜0.01)，且HM組明顯高于HL組及HH組(P＜0.01)，提示氫氣菌群制劑能夠改善肺組織GSH含量，且中等劑量效果最好(表3)。

表3 急性缺氧大鼠各組給藥后肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=8)Tab.3 Changes of indicators in lung tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

表3 急性缺氧大鼠各組給藥后肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=8)Tab.3 Changes of indicators in lung tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

MDA. Malonaldehyde; CAT. Catalase; SOD. Superoxide dismutase; GSH. Glutathione; NS. Plain saline group; HS. Plateau saline group, HL. Plateau low dose hydrogen group, HM. Medium dose hydrogen group; HH. High dose hydrogen group. (1)P＜0.01, (2)P＜0.05 compared with NS group; (3)P＜0.01, (4)P＜0.05 compared with HS group; (5)P＜0.01 compared with HL group; (6)P＜0.01 compared with HM group

GSH(μmol/g prot)NS 0.57±0.20 0.26±0.05 1.64±0.22 5.97±1.70 HS 1.64±0.13(1) 0.29±0.07 1.63±0.40 4.14±1.20(2)HL 1.28±0.29(1)(4) 0.55±0.15(3)2.07±0.53 4.99±1.38 HM 1.22±0.36(1)(4) 0.61±0.13(3)2.71±0.80(3)(5)7.17±2.11(3)(6)HH 1.61±0.25(1)(5)(6)0.59±0.05(3)1.89±0.35(6) 4.88±0.98(6)Group MDA(nmol/mg prot)CAT(U/ml)SOD(U/mg prot)

2.5 給藥后大鼠心肌組織MDA、CAT、SOD和GSH含量變化 與NS組相比，HS組與高原各藥物組大鼠心肌組織MDA含量均明顯增加(P＜0.01)，與HS組相比，HL組、HM組及HH組大鼠心肌組織MDA含量均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，HL組、HM組及HH組之間比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑可改善缺氧大鼠心肌組織的MDA含量增加。與NS組相比，HS組及高原各藥物組大鼠心肌組織CAT含量無明顯變化，與HS組相比，HH組大鼠心肌組織CAT含量明顯下降(P＜0.05)，HL組和HM組均明顯高于HH組(P＜0.01)，HL組與HM組比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑在改善缺氧大鼠心組織的CAT含量方面無明顯效果，且高劑量組還可導(dǎo)致CAT含量進(jìn)一步下降。與NS組相比，HS組、HL組及HH組大鼠心肌組織SOD含量無明顯變化，HM組大鼠心肌組織SOD含量明顯增加，與HS組相比，HL組及HM組大鼠心肌組織SOD含量明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，而HH組無明顯變化，HL、HM及HH組之間比較無明顯差異，提示氫氣菌群制劑能夠改善大鼠心組織SOD含量，且以中等劑量為最佳。與NS組相比，HS組大鼠心肌組織GSH含量明顯下降(P＜0.01)，而高原各藥物組無顯著改善，與HS組相比，HL組、HM組及HH組大鼠心肌組織GSH含量均明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，且HH組明顯高于HL組及HM組(P＜0.01)，HL組與HM組之間比較無明顯差異，表明氫氣菌群制劑能夠提高缺氧大鼠心肌組織的GSH含量，且高劑量組的效果較好，優(yōu)于低劑量組與中劑量組(表4)。

表4 急性缺氧大鼠各組給藥后心肌組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化(±s，n=8)Tab.4 Changes of indicators in heart tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

表4 急性缺氧大鼠各組給藥后心肌組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化(±s，n=8)Tab.4 Changes of indicators in heart tissue of acute hypoxia rats in different groups after administration (±s, n=8)

MDA. Malonaldehyde; CAT. Catalase; SOD. Superoxide dismutase; GSH. Glutathione; NS. Normoxic saline group; HS. High altitude saline group, HL. High altitude low-dose group, HM. High altitude medium-dose group; HH. High altitude high-dose group. (1)P＜0.01 compared with NS group; (2)P＜0.01, (3)P＜0.05 compared with HS group; (4)P＜0.05 compared with HL and HM group

GSH(μmol/g prot)NS 0.68±0.23 1.57±0.34 0.95±0.30 4.02±1.40 HS 1.94±0.71(1) 1.64±0.12 0.90±0.10 2.09±0.44(1)HL 1.52±0.28(1)(3) 1.72±0.26 1.14±0.19(3) 2.39±0.42(3)HM 1.33±0.36(1)(3) 1.72±0.21 1.36±0.22(1)(2)2.47±0.52(3)HH 1.25±0.43(1)(3) 1.42±0.13(3)0.97±0.16 3.38±0.91(2)(4)Group MDA(nmol/mg prot)CAT(U/ml)SOD(U/mg prot)

3 討 論

正常情況下，機(jī)體不斷生成自由基，同時(shí)也存在自由基的清除體系如抗氧化酶等，使自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，以保證機(jī)體不受自由基的損傷[7]。在高原低氧環(huán)境中，自由基代謝紊亂，自由基生成明顯增多，過多的自由基可造成組織損傷[5]。肝臟是機(jī)體最重要的代謝器官，肺臟是最主要的氣體交換場所，而心臟是對氧代謝特別敏感的器官，因此，本研究驗(yàn)選擇了肝臟、肺臟和心臟作為靶器官，觀察氫氣菌群制劑在大鼠急性缺氧后對機(jī)體氧化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的影響。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可提示機(jī)體的自由基代謝狀態(tài)并能夠間接反映自由基對組織的損傷程度[8]。SOD、CAT及GSH是機(jī)體重要的抗氧化系統(tǒng)，在機(jī)體拮抗氧化應(yīng)激損傷和清除自由基的過程中發(fā)揮著重要作用[9]。本研究選擇的是能夠在腸道中代謝產(chǎn)生氫氣的菌群，進(jìn)入消化道之后可在腸道定居并增殖以增加體內(nèi)氫氣的產(chǎn)量，促進(jìn)機(jī)體對氫氣的吸收以拮抗自由基的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，在模擬海拔5000m暴露3d，應(yīng)用氫氣菌群制劑后，能夠降低缺氧大鼠血漿TNF-α含量，降低缺氧大鼠肺組織和心肌組織的MDA含量，增加缺氧大鼠肝、肺以及心肌組織的GSH含量，增加肺組織CAT含量與肺、心肌組織SOD含量。上述結(jié)果表明，氫氣菌群制劑能夠在一定程度上中和缺氧導(dǎo)致的氧代謝自由基增加，對心肌組織和肺組織都有一定程度的保護(hù)作用。此外，本研究還觀察到，在單純?nèi)毖踅M中各組織的MDA、CAT、SOD和GSH指標(biāo)反應(yīng)并不一致，考慮一方面可能與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中個(gè)體對藥物的反應(yīng)不同有關(guān)，另外也可能與各組織對氫氣代謝反應(yīng)的不一致有關(guān)。給予氫氣菌群制劑后經(jīng)代謝產(chǎn)生氫氣，但是每只動(dòng)物的產(chǎn)氫氣的量不一致，氫氣通過各種中間過程到達(dá)各組織的途徑不一致，到達(dá)的量也不一樣，從而使得HS組中MDA以及各抗氧化的指標(biāo)反應(yīng)并不一致。

目前針對抗缺氧的藥物研究較多，以各種植物提取物以及小分子化合物為主，如槲皮素[10]、黃芪甲苷[9]、苯乙醇苷[11]、天麻素[12]、醋甲唑胺[13]、四甲基哌啶衍生物[14]及單硝酸異山梨酯化合物等[15]?，F(xiàn)有研究多為觀察自由基及抗缺氧物質(zhì)等氧化損傷/抗氧化指標(biāo)在細(xì)胞水平[11]或者動(dòng)物組織中的含量變化[9-10,12-15]以評估抗缺氧物質(zhì)的效應(yīng)，本研究選取的MDA、CAT、SOD及GSH等也是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)較多采用的指標(biāo)，而部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則采用細(xì)胞活力等指標(biāo)。目前的抗氧化指標(biāo)雖然多，但仍缺少敏感、特異的抗缺氧指標(biāo)，這也是篩選抗缺氧藥物的重要方向之一?？谷毖跣?yīng)是一個(gè)整體效應(yīng)，是在面對低氧環(huán)境時(shí)整個(gè)機(jī)體的活動(dòng)能力，而不是僅僅停留在細(xì)胞或者組織層面。因此，針對藥物的抗缺氧效應(yīng)，可考慮以動(dòng)物的整體表現(xiàn)為評估指標(biāo)，如在低氧環(huán)境中的認(rèn)知能力和運(yùn)動(dòng)能力等行為學(xué)特征，并以此為基礎(chǔ)在組織、細(xì)胞及分子層面深入研究其機(jī)制。

氫氣是自然界中最小、結(jié)構(gòu)最簡單的分子，無色無味，具有極強(qiáng)的還原性。此外，由于其分子量小和電中性特點(diǎn)，能夠穿透生物膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核等部位，因此很有可能作為一種小分子生命信號傳遞物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)傳遞信息。人體內(nèi)的氫氣有兩個(gè)來源：一是皮膚從外界吸收，但是通過此途徑獲得的氫氣量非常少，二是腸道菌群代謝產(chǎn)生的氫氣，這也是人體內(nèi)氫氣最主要的來源。研究表明，氫氣能夠?qū)ρ踝杂苫M(jìn)行有針對性的清除，尤其是中和體內(nèi)氧化性較強(qiáng)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)如羥基等而發(fā)揮作用[6]。而且大量研究表明，氫氣相關(guān)制劑如富氫水等能夠抑制炎癥因子如TNF-α、IL-1β的生成，并降低自由基的含量，進(jìn)而減輕缺血再灌注損傷[16]。此外，富氫水還可通過抗炎抗氧化作用，減輕炎癥性腸病損傷[17]，改善多發(fā)性硬化模型小鼠的癥狀和減輕脫髓鞘病變[18]。除了炎癥病變外，富氫水還可通過促進(jìn)干擾素的表達(dá)來減低腫瘤的質(zhì)量和體積[19]，改善因化療導(dǎo)致的肝功能損傷[20]。上述研究結(jié)果提示，氫氣及其相關(guān)制劑有望在多種疾病的治療中得到進(jìn)一步應(yīng)用，改善機(jī)體癥狀。

本研究使用的是氫氣菌群制劑，依賴于腸道菌群代謝產(chǎn)生氫氣，這種方式不穩(wěn)定，易受原有的腸道菌群和飲食的影響。在后期的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，可考慮直接應(yīng)用富氫水腹腔注射處理動(dòng)物模型，對急性高原病動(dòng)物模型應(yīng)有較好的效果。此外，雖然本研究使用的是急性動(dòng)物模型，但是在高原紅細(xì)胞增多癥和高原肺動(dòng)脈高壓等慢性缺氧模型中，也可針對性使用氫氣菌群或者富氫水制劑，以觀察其對低氧損傷的拮抗作用。目前，尚無高原現(xiàn)場條件下制備富氫水的報(bào)道，在高原條件下富氫水的保存也存在一定難度，因此使用氫氣菌群制劑以改善高原地區(qū)人群的腸道菌群，增加高原人群腸道氫氣的生成，也是未來可以考慮的方式。值得注意的是，由于高原低氧環(huán)境會(huì)對腸道菌群的組成和含量造成明顯的影響[21]，因此針對需要長期在高原停留的人群，建議考慮長期應(yīng)用氫氣菌群制劑以獲得較好的效果。

綜上所述，本研究表明，使用氫氣菌群制劑可改善缺氧環(huán)境對心臟以及肺臟的損傷，通過拮抗自由基而對上述器官發(fā)揮保護(hù)作用。此外，氫氣菌群制劑的應(yīng)用方式還可進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整以發(fā)揮其最大效應(yīng)。而氫氣在這其中發(fā)揮作用的機(jī)制如何，是否還有其他因子也參與了這一過程，我們將在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步關(guān)注。