李東東，聶鴻濤，劉國(guó)龍，閆喜武

( 1.大連海洋大學(xué)，水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023; 2.大連海洋大學(xué)，遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116023 )

大竹蟶(Solengrandis)屬軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、簾蛤目、竹蟶科，廣泛分布于我國(guó)沿海地區(qū)，生活在潮間帶至20 m深的淺海，是重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類[1]。大竹蟶營(yíng)埋棲生活，以海水中微型浮游生物和有機(jī)碎屑為食[2]。大竹蟶個(gè)體大、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)極其豐富。我國(guó)海水養(yǎng)殖貝類技術(shù)發(fā)展日益精進(jìn)，生物學(xué)家越來(lái)越重視貝類遺傳育種以及貝類保護(hù)的研究[3]。但近年來(lái)，海域環(huán)境污染嚴(yán)重和過(guò)度捕撈等原因?qū)е麓笾裣|的現(xiàn)存資源量越來(lái)越少，因此，大竹蟶的人工規(guī)模養(yǎng)殖對(duì)保護(hù)和恢復(fù)大竹蟶資源有重要意義。

鹽度、干露是水產(chǎn)養(yǎng)殖中比較重要的兩個(gè)非生物因子，影響著水生生物的生理及存活。聶鴻濤等[4]研究表明，鹽度對(duì)大竹蟶耗氧率和排氨率具有較大的影響。高杉等[5]研究表明，鹽度突變至15和35后，大竹蟶稚貝會(huì)長(zhǎng)期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，且大竹蟶稚貝培育的最適鹽度為20～30。陳愛(ài)華等[6]研究表明，鹽度對(duì)大竹蟶稚貝的生長(zhǎng)及存活有較大影響，大竹蟶稚貝最適宜存活的鹽度為20～32，鹽度20時(shí)，成活率最大，為85%；最適生長(zhǎng)的鹽度為20～28，鹽度24時(shí)，大竹蟶稚貝日生長(zhǎng)率最大，為1.72%。鹽度突變不僅可以影響免疫因子使機(jī)體的免疫能力下降，還可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)影響機(jī)體的免疫能力。張鷺等[7]指出，縊蟶(Sinonovaculacomstricata)在低鹽條件下，血淋巴中磷脂酶A2和鋅指蛋白等6種蛋白會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致縊蟶的死亡率顯著增加。近年來(lái)，關(guān)于干露條件對(duì)貝類影響的研究在長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[8]、墨西哥灣扇貝(Argopectenirradiansconcentricus)幼蟲(chóng)和稚貝[9]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)幼苗[10]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)幼蟲(chóng)[11]等中均有報(bào)道。長(zhǎng)牡蠣成貝的耐干露能力較其稚貝強(qiáng)，并且在低溫條件下干露成活率顯著高于高溫[8]。

呼吸代謝是直接反應(yīng)生物機(jī)體能量代謝的基本生理活動(dòng)，不僅能反映生物體代謝特征、生理狀態(tài)及營(yíng)養(yǎng)情況，還能反應(yīng)環(huán)境條件對(duì)生物生理活動(dòng)的影響程度，是水生動(dòng)物生理學(xué)研究的重要內(nèi)容之一[12-13]。水產(chǎn)動(dòng)物呼吸代謝類型主要為有氧方式，但在低氧條件下也可通過(guò)無(wú)氧呼吸代謝方式為機(jī)體提供能量[14]。乳酸脫氫酶是生物機(jī)體無(wú)氧條件下糖酵解過(guò)程中參與調(diào)節(jié)的重要酶類，其活性可以用來(lái)反映無(wú)氧呼吸代謝能力[15]。琥珀酸脫氫酶是有氧代謝的首要酶類和衡量指標(biāo)，在三羧酸循環(huán)中起到連接氧化磷酸化與電子傳遞的作用，為細(xì)胞線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子[13]。在機(jī)體代謝中，堿性磷酸酶發(fā)揮著重要作用，當(dāng)堿性磷酸酶活性降低后，生物體的免疫和代謝能力均會(huì)受到影響[16]。

在大竹蟶的養(yǎng)殖中，大竹蟶對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力受諸多環(huán)境因子的影響,其中鹽度和干露是兩個(gè)重要的環(huán)境因子，對(duì)大竹蟶的呼吸、代謝、生長(zhǎng)和免疫等有著十分重要的作用[17-19]。消化腺是軟體動(dòng)物消化和代謝的中心，在貝類消化腺中代謝酶活性處于較高水平[20]。目前，大竹蟶人工育苗、遺傳多樣性等方面的研究已有報(bào)道[21-23]，但鮮見(jiàn)鹽度和干露對(duì)其影響的相關(guān)研究。筆者以大竹蟶消化腺中呼吸代謝酶活性變化作為指標(biāo)，來(lái)反應(yīng)鹽度和干露脅迫對(duì)大竹蟶呼吸代謝功能的影響，旨在為大竹蟶的人工規(guī)?；B(yǎng)殖、育成、運(yùn)輸提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大竹蟶取自大連灣海域，殼長(zhǎng)(9.16±0.5) cm,殼寬(1.54±0.38) cm,殼高(1.52±0.5) cm，濕質(zhì)量(41.85±0.88) g。在50 cm×30 cm×35 cm的水槽內(nèi)適應(yīng)性暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間，海水鹽度30±1，水溫(14±1) ℃，持續(xù)充氧，日換水1次；定時(shí)投喂螺旋藻(Spirulina)粉，日投喂2次，試驗(yàn)前2 d停止投餌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫試驗(yàn)

相同試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)設(shè)置鹽度脅迫和干露脅迫兩組。

鹽度脅迫：暫養(yǎng)結(jié)束后，將大竹蟶隨機(jī)分為5組，以每個(gè)水槽30個(gè)的密度將大竹蟶置于5個(gè)鹽度梯度(15、20、25、30、35鹽度組，30作為對(duì)照組)的水槽中，每個(gè)水槽中水溫24～26 ℃，pH 8.1～8.3。低鹽度的調(diào)節(jié)是使用經(jīng)過(guò)曝氣處理的自來(lái)水加入到海水中調(diào)節(jié)，鹽度35高鹽調(diào)節(jié)是將鹽水精加入到海水中調(diào)節(jié)。每個(gè)處理3個(gè)平行，均在相同條件下脅迫10 d。脅迫時(shí)日換水1次、投餌2次，持續(xù)充氣。

干露脅迫：脅迫前挑選經(jīng)馴化7 d后活性良好

的大竹蟶，設(shè)置4個(gè)處理組，放入水槽中，水槽底部鋪滿過(guò)濾海水浸濕過(guò)的沙子，厚10 cm。每個(gè)脅迫時(shí)間組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放30個(gè)大竹蟶。分別于室溫條件下干露6、12、24、48 h，每個(gè)水槽中各取3個(gè)大竹蟶的消化腺用于試驗(yàn)分析。對(duì)照組在相同條件下養(yǎng)殖。

1.2.2 樣品處理

鹽度脅迫試驗(yàn)和干露脅迫試驗(yàn)每個(gè)平行組取3個(gè)大竹蟶樣品。將脅迫后的大竹蟶置于冰盤上迅速解剖，每個(gè)個(gè)體取消化腺0.2～0.4 g，放入預(yù)冷的勻漿器中，加入4倍體積預(yù)冷的0.9%生理鹽水，制備成組織勻漿液，于高速冷凍離心機(jī)中4 ℃、4000 r/min，離心10 min，取上清液用于酶活性檢測(cè)。

1.3 蛋白含量和呼吸代謝酶活性的測(cè)定

乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶活性用微量酶標(biāo)法測(cè)定，總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定，具體測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。乳酸脫氫酶活力單位定義為：37 ℃反應(yīng)條件下，每克組織蛋白與基質(zhì)反應(yīng)15 min，反應(yīng)體系中生成1 μL丙酮酸為1個(gè)酶活力單位(U)；琥珀酸脫氫酶活力單位定義為：37 ℃ 條件下，每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系的吸光值降低0.01為1個(gè)酶活力單位(U)；堿性磷酸酶活力單位定義為：37 ℃條件下，每克組織蛋白與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較，以P<0.05作為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度和干露對(duì)大竹蟶堿性磷酸酶活力的影響

鹽度逐步升高時(shí)，大竹蟶消化腺堿性磷酸酶活力隨時(shí)間變化見(jiàn)圖1，大竹蟶堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高呈先降后升的變化趨勢(shì)。鹽度20時(shí)，大竹蟶堿性磷酸酶活性最低，為0.043 U/g，且顯著低于其他各組(P<0.05)；而后逐漸恢復(fù)，鹽度25、30和35時(shí)，大竹蟶堿性磷酸酶活力變化不顯著(P>0.05)，鹽度25時(shí)，大竹蟶堿性磷酸酶活力處于較高水平，為0.053 U/g，顯著高于鹽度35時(shí)的活力(P<0.05)。

圖1 鹽度對(duì)大竹蟶消化腺堿性磷酸酶活力的影響相同小寫(xiě)字母表示組間差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同.

干露時(shí)間對(duì)大竹蟶堿性磷酸酶活性的變化見(jiàn)圖2。隨著干露時(shí)間的延長(zhǎng)，大竹蟶消化腺中堿性磷酸酶活性隨著干露時(shí)間的增加而降低，各組堿性磷酸酶活力變化無(wú)顯著差異(P>0.05)。干露6 h時(shí)堿性磷酸酶活力最高，為0.042 U/g，干露48 h時(shí)堿性磷酸酶活力最低，為0.020 U/g。

2.2 鹽度和干露對(duì)大竹蟶琥珀酸脫氫酶活力的影響

在鹽度脅迫下，各個(gè)鹽度組的大竹蟶消化腺琥珀酸脫氫酶活力變化見(jiàn)圖3。隨著鹽度的變化，消化腺琥珀酸脫氫酶活力出現(xiàn)了先降后升最后恢復(fù)的變化，鹽度20組琥珀酸脫氫酶活力降低，與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，鹽度25組的琥珀酸脫氫酶變化明顯，顯著升高(P<0.05)，為0.401 U/mg，高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)，鹽度15組和鹽度35組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

不同干露時(shí)間脅迫下，大竹蟶琥珀酸脫氫酶活性變化見(jiàn)圖4，隨著干露時(shí)間的延長(zhǎng)，消化腺中琥珀酸脫氫酶活性變化顯著(P>0.05)，干露脅迫6、12、24 h，琥珀酸脫氫酶活性顯著高于48 h時(shí)的活性，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性呈降低的趨勢(shì)(P>0.05)，48 h達(dá)到最低，為0.197 U/mg。其中，干露脅迫6 h時(shí)琥珀酸脫氫酶活性為0.538 U/mg，且顯著高于12 h時(shí)的活性(P<0.05)；干露脅迫12 h時(shí)和24 h時(shí)琥珀酸脫氫酶活性分別為0.302 U/mg和0.311 U/mg，顯著高于48 h時(shí)的活性(P>0.05)。

圖3 鹽度對(duì)大竹蟶消化腺琥珀酸脫氫酶活力的影響

圖4 干露時(shí)間對(duì)大竹蟶消化腺琥珀酸脫氫酶活力的影響

2.3 鹽度和干露對(duì)大竹蟶乳酸脫氫酶活力的影響

隨著鹽度的增加，大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活性變化見(jiàn)圖5。乳酸脫氫酶活力出現(xiàn)先降后升再恢復(fù)的變化。鹽度20時(shí)，乳酸脫氫酶活力為0.287 U/g，顯著低于鹽度15時(shí)的活力(0.437 U/g)(P>0.05)。鹽度25時(shí)，乳酸脫氫酶活力為0.604 U/g，顯著高于鹽度15時(shí)的活力(P<0.05)。鹽度30、35時(shí)，乳酸脫氫酶活力呈波動(dòng)變化，但差異不顯著(P>0.05)。

干露脅迫下，大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活力隨時(shí)間變化見(jiàn)圖6。干露脅迫6 h時(shí)與0、12、24 h時(shí)大竹蟶消化腺的乳酸脫氫酶活力差異不顯著(P>0.05)，但干露脅迫48 h時(shí)大竹蟶消化腺的乳酸脫氫酶活性(0.187 U/g)明顯降低，顯著低于干露脅迫0、6、12 h和24 h時(shí)的活性(P<0.05)。

圖5 鹽度對(duì)大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活力的影響

圖6 干露時(shí)間對(duì)大竹蟶消化腺乳酸脫氫酶活力的影響

3 討 論

3.1 鹽度對(duì)大竹蟶呼吸代謝酶活力的影響

乳酸脫氫酶是調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝中無(wú)氧代謝酶之一，乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸還原成乳酸，才能使糖酵解順利進(jìn)行[24]，所以能使機(jī)體糖酵解正常運(yùn)行的前提條件是乳酸脫氫酶保持其活性[25]。乳酸脫氫酶與細(xì)胞代謝活動(dòng)密切相關(guān)，是糖酵解與三羧酸循環(huán)之間的關(guān)鍵酶，其活力大小在一定程度上反映了無(wú)氧條件下生物代謝能力的強(qiáng)弱[26]，可作為衡量無(wú)氧代謝水平的指標(biāo)之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)鹽度為25時(shí)，大竹蟶乳酸脫氫酶活力較高，說(shuō)明在靠近等滲點(diǎn)的環(huán)境中，機(jī)體內(nèi)無(wú)氧代謝水平較高，有助于為大竹蟶的運(yùn)動(dòng)提供能量保障。隨著內(nèi)外滲透梯度的增大，大竹蟶乳酸脫氫酶活力下降，無(wú)氧代謝水平降低，使得進(jìn)入三羧酸循環(huán)的丙酮酸含量增加，三羧酸循環(huán)速度加快，從而為機(jī)體提供更多的能量以適應(yīng)環(huán)境的變化，琥珀酸脫氫酶活力的變化也證明了這一點(diǎn)。

堿性磷酸酶是參與生物體代謝調(diào)控的重要酶類，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，鈣代謝等，對(duì)于細(xì)胞調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收具有重要作用,是評(píng)價(jià)生物體生長(zhǎng)和免疫的重要指標(biāo)[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度20時(shí)大竹蟶的堿性磷酸酶的活性顯著低于鹽度15、25、30、35時(shí)的活性，且當(dāng)高鹽度脅迫時(shí)大竹蟶堿性磷酸酶的活力顯著低于對(duì)照組的活力(P<0.05)。這說(shuō)明鹽度為20、35時(shí)，對(duì)大竹蟶堿性磷酸酶活性的影響較大，且低鹽度的影響顯著高于高鹽度的影響。王瑞芳等[28]的研究表明，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的堿性磷酸酶活性在高鹽度(35)時(shí)顯著低于在低鹽度(28)時(shí)，且堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高而降低。本試驗(yàn)的結(jié)果與其不同，可能與物種的不同有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，堿性磷酸酶活力在鹽度25時(shí)最高，但與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，后隨鹽度增加其活性逐步下降，表現(xiàn)出了堿性磷酸酶的滯后性，這與中國(guó)血蛤(Hiatulachinensis)在低鹽度下免疫反應(yīng)遲緩的結(jié)果一致[29]，可能是由于低鹽下某些特異性因子受到抑制所致[28]。綜上可知，鹽度25接近大竹蟶堿性磷酸酶活性隨鹽度變化的臨界值。

琥珀酸脫氫酶參與氧化磷酸化作用和三羧酸循環(huán)，是呼吸鏈中的第一個(gè)酶，在進(jìn)行有氧呼吸時(shí)，琥珀酸脫氫酶在三羧酸循環(huán)中將延胡索酸還原成琥珀酸，為機(jī)體提供能量，從而其活力可在一定程度上反應(yīng)有氧代謝的水平[30]。在本試驗(yàn)中，琥珀酸脫氫酶活性的變化呈“W”型。從整體變化來(lái)看，大竹蟶的最適鹽度為25～35，且當(dāng)鹽度為25時(shí)，酶活性達(dá)到最高，琥珀酸脫氫酶活力較高，說(shuō)明此時(shí)大竹蟶機(jī)體的有氧代謝水平最高。本試驗(yàn)中不同鹽度下，琥珀酸脫氫酶活力差異的消除也可能與長(zhǎng)時(shí)間的鹽度馴化有關(guān)。隨著大竹蟶的在脅迫鹽度下的適應(yīng)，其自身的有氧呼吸代謝能力增強(qiáng)，琥珀酸脫氫酶活力增高。

3.2 干露對(duì)大竹蟶呼吸代謝酶活力的影響

海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類在養(yǎng)殖和運(yùn)輸中會(huì)遭受干露脅迫，干露時(shí)間決定脅迫強(qiáng)度。當(dāng)貝類離開(kāi)水環(huán)境后，需要維持自身的生命力，但是由于缺水后不能進(jìn)行正常的呼吸作用，會(huì)導(dǎo)致貝類窒息死亡。貝類對(duì)干露脅迫的耐受能力與干露時(shí)間的長(zhǎng)短、規(guī)格的差異、物種的不同均有一定的關(guān)系，且與時(shí)間、溫度成負(fù)相關(guān)；相同物種中，由于成貝的軟體部比稚貝大，體內(nèi)含水量相對(duì)較多，成貝比稚貝具有更強(qiáng)的耐干露能力，成活率高[8]。

大竹蟶生活在潮間帶到20 m水深的淺海，埋棲在深度30～40 cm的泥灘或沙灘中。在自然界中，除了受到溫度、鹽度和其他環(huán)境條件的影響外，由于四季變換、環(huán)境突變等，大竹蟶也會(huì)受到不同程度干露的脅迫，自身的呼吸代謝酶活力會(huì)受到影響[1]。通過(guò)測(cè)定不同干露時(shí)間下堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶的活性，掌握干露時(shí)間對(duì)大竹蟶呼吸代謝酶活力的變化規(guī)律，從而探明干露對(duì)大竹蟶耐受能力的影響。在缺氧或者動(dòng)物機(jī)體本身代謝過(guò)于旺盛但氧氣供應(yīng)不足的環(huán)境條件下，機(jī)體能量的供應(yīng)主要通過(guò)糖酵解作用，堿性磷酸酶對(duì)糖酵解也有著重要作用[24]。堿性磷酸酶是溶酶體中重要的溶解酶，直接參與體內(nèi)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，與一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收相關(guān)[31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著干露時(shí)間的延長(zhǎng)，3種酶的活力呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢(shì)。隨著干露時(shí)間的延長(zhǎng)，琥珀酸脫氫酶的活力逐漸降低，當(dāng)干露時(shí)間超過(guò)24 h后，下降愈發(fā)明顯，表明隨著干露時(shí)間延長(zhǎng)，大竹蟶的有氧代謝水平逐漸降低。隨著干露時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸脫氫酶活力呈現(xiàn)總體下降趨勢(shì)，但當(dāng)干露時(shí)間延長(zhǎng)至24 h，其活性較12 h時(shí)略有上升。隨著干露時(shí)間延長(zhǎng)，大竹蟶的琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活力均呈先降低后平穩(wěn)再下降的變化趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。表明干露脅迫24 h后，大竹蟶機(jī)體仍具有自我修復(fù)能力，但長(zhǎng)時(shí)間的干露必然會(huì)損傷大竹蟶的代謝能力，與段亞飛等[32]的研究結(jié)果一致。隨著干露時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性磷酸酶活力呈持續(xù)下降趨勢(shì)，各梯度下的酶活力差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，大竹蟶耐干露的時(shí)間范圍在24 h以內(nèi)，超出這一范圍，其存活率和酶活力均出現(xiàn)不可逆的急劇下降。