閆宏晨，王玉風(fēng)，李 蘭，沈 偉，程順峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山東 青島 266109)

多能干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells, ASCs)，是一類具有巨大潛能的獨(dú)特細(xì)胞，不僅具有自我更新能力，且在一定誘導(dǎo)條件下能夠分化形成具有特定功能的成熟細(xì)胞[1]。ASCs主要作用是更新生理性死亡的細(xì)胞或組織受損時(shí)的代償性增生[2]。近年來(lái)，在人[3]、小鼠[4]、猴子[5]等物種的皮膚組織中都發(fā)現(xiàn)了ASCs。皮膚是哺乳動(dòng)物中少有的可以持續(xù)自我更新組織成分(表皮和真皮)和結(jié)構(gòu)(毛囊、皮脂腺和汗腺)的器官之一，該特性甚至?xí)３种脸赡闧6]，究其原因是由于皮膚組織中具有多種類型的皮膚干細(xì)胞[7]。皮膚干細(xì)胞是一種重要的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，是表皮、皮脂腺和毛囊細(xì)胞更新和修復(fù)的細(xì)胞來(lái)源。皮膚干細(xì)胞主要來(lái)源于兩個(gè)部位，一是表皮基底層[8-9]，二是毛囊，毛囊干細(xì)胞主要位于毛囊外根鞘的隆突區(qū)，即bulge[10-12]。皮膚來(lái)源干細(xì)胞(skin-derived stem cells，SDSCs)數(shù)量豐富，易于收集，Lermen等[7]報(bào)道采用微創(chuàng)方式獲得的用于活檢的小塊皮膚對(duì)于分離SDSCs已經(jīng)足夠了。

豬在機(jī)體解剖結(jié)構(gòu)、主要內(nèi)臟器官大小和生理功能方面與人類非常相似[12]，因此在移植治療和人類疾病模型建立方面，豬將會(huì)成為一種重要的生物學(xué)模型。目前已有眾多關(guān)于分離胎豬皮膚干細(xì)胞的研究報(bào)道[7,13-14]。然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于出生后豬皮膚干細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道，原因在于對(duì)出生后豬SDSCs缺乏有效的分離方法，很難獲得純度高、活性好的SDSCs[7,13,15]。如何獲得具有良好生物學(xué)性能的干細(xì)胞是目前SDSCs研究領(lǐng)域中亟待解決的問題。本試驗(yàn)通過分離和鑒定新生仔豬皮膚干細(xì)胞，旨在建立一種仔豬皮膚干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步分析仔豬皮膚干細(xì)胞的生物學(xué)特性奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新生24 h內(nèi)的仔豬購(gòu)自青島市城陽(yáng)區(qū)上馬鎮(zhèn)海東屯養(yǎng)豬合作社。

本試驗(yàn)所使用抗體包括鼠抗Cytokeratin 15 (Sigma，SC47697)，兔抗Integrin β1 (Sangon， D12086)，兔抗OCT4( Abcam，AB18976)，兔抗SOX2( Sangon，D121248)，異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Sigma，F(xiàn)9006)，Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Sigma，A0516)。

DMEM/F12(1:1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素(Penicuuin-streptomycin，PS)等購(gòu)自HyClone公司；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF) (2028EG)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF) (100-18B)分別購(gòu)自Sigma和Peprotech公司。

1.2 豬皮膚組織切片與HE染色

取新生仔豬不同部位皮膚組織，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)清洗3次，4%多聚甲醛4 ℃固定12 h。組織塊在70%、80%、90%、95%、100%乙醇中依次脫水2 h；二甲苯透明20 min，重復(fù)2次；石蠟和二甲苯1：1混合液浸泡2 h，而后過夜浸蠟；修塊，切片機(jī)切片，切片厚度5 μm。石蠟切片在65 ℃烘干2 h，二甲苯脫蠟15 min，重復(fù)兩次，梯度酒精浸泡(100%、95%、80%、70%、50%)每次5 min，蒸餾水2 min，而后蘇木精、伊紅染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.3 豬皮膚干細(xì)胞的分離

新生仔豬背部取3 cm×3 cm全層皮膚，含5% PS的PBS沖洗3次，無(wú)菌室內(nèi)75%乙醇浸泡5 min，PBS沖洗兩遍，體視顯微鏡下使用眼科剪和鑷子清理剪除表面毛干及邊緣不規(guī)則組織，隨后將處理的標(biāo)本剪成3 cm×0.5 cm的長(zhǎng)方形，置于直徑為3 cm 的培養(yǎng)皿中，加入0.5%膠原酶IV(Collagenase IV)4 ℃過夜消化，次日使用眼科剪將皮膚剪碎為1 mm3小塊，而后 37 ℃、0.25%胰蛋白酶消化5 min，吹打后過400目細(xì)胞篩獲得豬皮膚單細(xì)胞懸液，加入含有10 mL培養(yǎng)液的10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.4 豬皮膚干細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

分離的仔豬皮膚單細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)采用懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩種方式，即分離獲得的皮膚單細(xì)胞分別接種于懸浮培養(yǎng)皿和貼壁培養(yǎng)皿中，而后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的皮膚單細(xì)胞均采用干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12、1% PS、2% B-27、20 ng/mL EGF、40 ng/mL bFGF)。懸浮培養(yǎng)的干細(xì)胞每天觀察細(xì)胞形態(tài)，每72 h更換一半培養(yǎng)液。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行傳代時(shí)，吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，移液器輕輕吹打?yàn)閱渭?xì)胞，根據(jù)細(xì)胞密度按照合適比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待大部分貼壁培養(yǎng)的干細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每72 h更換一半培養(yǎng)液，在細(xì)胞達(dá)到70%～80%的匯合度后根據(jù)細(xì)胞密度按照合適比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5 免疫組化檢測(cè)

組織切片免疫熒光抗體檢測(cè)方法如下：取切好的石蠟切片65 ℃烘片，二甲苯脫蠟15 min，重復(fù)兩次，酒精梯度脫蠟(100%、95%、80%、70%、50%)；抗原修復(fù)液95 ℃水浴10 min，冷卻，PBS清洗3次，每次5 min；BDT封閉液(3% BSA,10%山羊血清的PBST溶液)室溫封閉30 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加一抗(Cytokeratin 15、Integrin β1)50 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；加FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG 100 μL(1:200)或CY3標(biāo)記羊抗小鼠IgG 100 μL(1:200)，37 ℃溫育1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加30 μL Hoechst 33342室溫孵育10 min，PBS清洗3遍，滴加防熒光淬滅劑，封片熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)

培養(yǎng)的克隆團(tuán)細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，滴加到干凈載玻片上，37 ℃烘干；PBS洗3次，每次5 min；含0.5% Triton-100的PBS透化10 min，PBS洗3次，每次5 min；加含10%山羊血清、0.5% Triton-100的PBS室溫封閉45 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加一抗(Cytokeratin 15、Integrin β1、OCT4 或SOX2)50 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；加FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG 100 μL(1:200)或CY3標(biāo)記羊抗小鼠IgG 100 μL(1:200)，37 ℃溫育1 h，PBS洗3次，每次5 min；加Hoechst，浸泡3 min ；封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.7 核型分析

培養(yǎng)液中適量添加濃度為100 μg/mL的秋水仙素溶液，使其終濃度達(dá)到0.3 μg/mL處理3.5～4 h， 隨后0.25 %的胰酶消化收集細(xì)胞；加入37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCL低滲處理；加入Carnoy氏固定液(甲醇：冰乙酸=3：1)固定20 min，300 g離心5 min，收集細(xì)胞，取適量細(xì)胞懸液滴到預(yù)冷載玻片上，晾干后吉姆薩染色，顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮膚組織HE染色及免疫熒光鑒定結(jié)果

取新生仔豬的頭、頸、腹、背、前肢和后腿等6個(gè)部位皮膚組織進(jìn)行包埋、切片，隨后進(jìn)行Integrin β1和Cytokeratin 15(K15)的雙重免疫熒光抗體染色。結(jié)果如圖1所示，紅色I(xiàn)ntegrin β1陽(yáng)性信號(hào)主要集中于毛囊的外根鞘基部近內(nèi)根鞘側(cè)，尤其是毛囊根部(圖1 A3-F3)。綠色K15陽(yáng)性信號(hào)主要表達(dá)在毛囊外根鞘外側(cè)(圖1，A4-F4)，與人、小鼠及絨山羊處于休止期的毛囊表達(dá)的位置相似[16]。在毛囊基底部有些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)K15和Integrin β1陽(yáng)性信號(hào)。在毛囊的上半部分表達(dá)Integrin β1陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞數(shù)目多于表達(dá)K15的細(xì)胞(圖2)。

2.2 豬毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果

采用貼壁法原代培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞培養(yǎng)4～5 d后，可見少量卵圓狀細(xì)胞從組織塊周邊遷出(圖3A)，之后卵圓狀細(xì)胞生長(zhǎng)較快，原代培養(yǎng)8～10 d后形成團(tuán)塊狀克隆(圖3B)，光鏡觀察可見細(xì)胞大小較為一致，細(xì)胞輪廓清晰，呈鵝卵石狀，部分克隆周邊有少許遷出的其他形態(tài)的細(xì)胞，但未形成擴(kuò)增趨勢(shì)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，呈團(tuán)塊狀克隆生長(zhǎng)(圖3C，3D)。但是傳代到P5代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，傳代時(shí)間加長(zhǎng)，且伴隨有大量卵圓形細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞現(xiàn)象。

圖2 背部皮膚HE染色及免疫組化結(jié)果A1.Hoechst；B1.HE；A2.Integrin β1；B2.Cytokeratin 15； A3.Merge；B3.放大圖;標(biāo)尺=100 μm

采用懸浮培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)的干細(xì)胞4～5 d后逐漸增殖形成結(jié)構(gòu)松散的20～30個(gè)細(xì)胞聚集小克隆(圖4A)，傳代時(shí)將克隆團(tuán)吹打成原來(lái)體積的1/2～1/4。P1 代的克隆生長(zhǎng)速度很快，并且克隆球表面逐漸變得光滑平整，克隆較之前P0代的時(shí)候更大(圖4B)， 經(jīng)過2次傳代培養(yǎng)，干細(xì)胞逐漸增殖并純化，雜細(xì)胞基本被去除(圖4C)。緊密生長(zhǎng)的細(xì)胞呈明亮且邊緣光滑克隆生長(zhǎng)。細(xì)胞傳代到P2代時(shí)，克隆球數(shù)目不斷增加，內(nèi)部細(xì)胞變得更加緊湊，克隆團(tuán)邊緣清晰并且折光性更強(qiáng)(圖4D)。

2.3 培養(yǎng)干細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果

懸浮培養(yǎng)的P3代毛囊干細(xì)胞消化成單細(xì)胞后細(xì)胞滴片，進(jìn)行Integrin β1和K15的免疫熒光染色鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)分離擴(kuò)增獲得的克隆團(tuán)中的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Integrin β1和K15(圖5)。消化的干細(xì)胞進(jìn)行的SOX2和OCT4免疫熒光染色也證明培養(yǎng)的干細(xì)胞呈現(xiàn)SOX2和OCT4陽(yáng)性(圖6)。取P3代的細(xì)胞，免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用貼壁培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細(xì)胞中Integrin β1、K15、SOX2和OCT4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相比采用懸浮培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細(xì)胞明顯減少。

2.4 染色體核型分析

顯微鏡下觀察懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)200個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目。核型分析結(jié)果(圖7)表明, 毛囊干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中染色體數(shù)目正常且2n=38。

圖4 懸浮培養(yǎng)的原代及傳代新生豬皮膚干細(xì)胞A.原代培養(yǎng)4～5 d細(xì)胞；B.第1代干細(xì)胞；C.第2代干細(xì)胞；D.第2代干細(xì)胞形成克隆團(tuán)；標(biāo)尺=100 μm

圖5 傳代培養(yǎng)的新生豬皮膚干細(xì)胞Integrin β1和Cytokeratin 15免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果A.Hoechst;B.Integrin β1;C.Cytokeratin 15;D.Merge；bar=25 μm

圖6 傳代培養(yǎng)的新生豬皮膚干細(xì)胞SOX2和OCT 4免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果A1.光鏡；A2.Hoechst;A3.SOX2；A4.Merge；B1.光鏡；B2.Hoechst：B3.OCT4；B4.Merge；標(biāo)尺=25 μm

3 討 論

目前關(guān)于哺乳動(dòng)物皮膚干細(xì)胞分離培養(yǎng)的報(bào)道中采用材料多為未出生胎兒，如2006年Dyce等[13]報(bào)道胎豬皮膚干細(xì)胞可分化為原始生殖細(xì)胞；2015年Ge等[6]成功培養(yǎng)了人胎兒皮膚干細(xì)胞，并證實(shí)其同樣可分化為原始生殖細(xì)胞。盡管2009年Lermen等[7]首次利用六月齡豬皮膚分離培養(yǎng)了干細(xì)胞，但未見該研究組的后續(xù)報(bào)道。本研究以出生24 h內(nèi)的新生仔豬為材料，采用懸浮培養(yǎng)方式成功獲得了新生豬皮膚干細(xì)胞。之所以采用出生24 h內(nèi)的新生豬而未采用生長(zhǎng)時(shí)間更長(zhǎng)的豬作為試驗(yàn)材料，主要原因在于成年豬皮膚中的干細(xì)胞數(shù)量和種類相對(duì)于新生豬較少，且干細(xì)胞分化程度更低。吳永勝和陳曉蓉[17]指出胎兒皮膚中各種細(xì)胞處于比較幼稚的階段，并沒有形成結(jié)構(gòu)和功能完整的皮膚，此外胎兒皮膚較成人皮膚表皮干細(xì)胞數(shù)量多，且分化程度低，增殖能力強(qiáng)。但胎豬、新生豬及成年豬的皮膚中干細(xì)胞數(shù)量和種類差異程度有多大，在細(xì)胞發(fā)育階段中的分子水平上存在何種不同還需進(jìn)一步研究確定。

圖7 體外培養(yǎng)的新生豬皮膚干細(xì)胞核型分析結(jié)果

本研究在鑒定皮膚干細(xì)胞時(shí)采用了Integrin β1和K15兩種蛋白標(biāo)記物。目前雖然關(guān)于皮膚干細(xì)胞標(biāo)記物還存在爭(zhēng)論，但比較一致認(rèn)可的標(biāo)記物主要有 Integrin β1、K15、K19等[16,18]。Integrin β1是異二聚體細(xì)胞表面糖蛋白，除介導(dǎo)基底干細(xì)胞黏附于基底層中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，還介導(dǎo)細(xì)胞間黏附。該蛋白在人和小鼠毛囊隆突處表達(dá)較高，在調(diào)控皮膚干細(xì)胞增殖分化的信號(hào)通路起重要作用，若Integrin β1表達(dá)下降，表明細(xì)胞幾次分裂后將開始分化[2,19]。K15、K19蛋白是表皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，是表皮的主要分化產(chǎn)物，該兩種蛋白構(gòu)成的微絲在細(xì)胞內(nèi)形成廣泛的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)細(xì)胞分化程度的不同，表皮細(xì)胞表達(dá)不同的角蛋白[12]，在表皮干細(xì)胞的分化過程中，K15表達(dá)的減少較K19表達(dá)的減少更早。因此K15表達(dá)的丟失是干細(xì)胞向短暫擴(kuò)增細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最早的征象之一。而K15陰性、K19陽(yáng)性的細(xì)胞可能是“早期”短暫擴(kuò)增細(xì)胞，提示K15較K19在鑒別表皮干細(xì)胞中更有意義[2-20]。此外，研究證明人和小鼠的皮膚干細(xì)胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位和毛囊間表皮基底層。本研究石蠟切片免疫染色結(jié)果亦顯示Integrin β1、K15陽(yáng)性細(xì)胞主要位于毛囊外根鞘基底層。根據(jù)懸浮培養(yǎng)獲得的細(xì)胞形態(tài)特征并結(jié)合多個(gè)蛋白標(biāo)記物(K15、Integrin β1、SOX2和OCT4)陽(yáng)性染色結(jié)果，可以確定通過本方法所獲得的細(xì)胞為皮膚干細(xì)胞。

為建立較為穩(wěn)定、效率更高的皮膚干細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，采用了懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)兩種原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法均可以得到細(xì)胞克隆團(tuán)，但獲得的干細(xì)胞進(jìn)行SOX2和OCT4免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少。另外發(fā)現(xiàn)采用該方法獲得原代細(xì)胞時(shí)間較長(zhǎng)，傳代間隔時(shí)間也較長(zhǎng)，且后期細(xì)胞容易分化。而采用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞則不存在該現(xiàn)象。范曉梅等[21]認(rèn)為由于細(xì)胞內(nèi)某些蛋白表達(dá)所受調(diào)控的復(fù)雜性，使得一些蛋白合成量可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)受影響；曹冬梅[22]發(fā)現(xiàn)大鼠附睪上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)Binlb蛋白(beta-defensin-like a peptide，β-防御素蛋白)表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少。Lefebvres等[23]確認(rèn)HLA-G蛋白(human leucocyte antigen-G，人白細(xì)胞抗原-G蛋白)在胸腺上皮和羊膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)量隨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。因此我們認(rèn)為傳代間隔時(shí)間較短的懸浮培養(yǎng)方法更適合新生仔豬皮膚干細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

本試驗(yàn)采用懸浮培養(yǎng)法，以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加B-27、EGF、bFGF等細(xì)胞因子，成功培養(yǎng)了新生仔豬皮膚干細(xì)胞，為仔豬皮膚干細(xì)胞多能性及多向分化的潛能的后續(xù)研究提供了試驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。