程蛟文 鐘 建 程雨柔 胡 芳 崔竣杰 胡開林*

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642；2佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528000）

苦瓜（Momordica charantiaL.）屬于葫蘆科苦瓜屬一年生攀援草本作物，廣泛分布于非洲和亞洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)（Schaefer & Renner，2010；Cui et al.，2017）。苦瓜因其果實含有葫蘆烷型三萜苦味化合物而得名（崔竣杰 等，2015）?？喙瞎麑嵅粌H營養(yǎng)豐富，而且具有降糖、降脂和抗病毒等多種生物藥理活性（Fang & Ng，2013；van Wyk，2015；Yang et al.，2016）。近年來，苦瓜消費需求和種植面積日益增加，已成為我國重要的瓜類蔬菜作物之一。近30 a來，許多育種工作者經(jīng)過不斷努力，使苦瓜品種實現(xiàn)了2～3次更新?lián)Q代，為苦瓜生產(chǎn)做出了重要貢獻(xiàn)。然而，由于苦瓜并非我國原產(chǎn)，國內(nèi)遺傳資源相對匱乏，遺傳背景較為狹窄；而且，長期以來育種工作者主要采用傳統(tǒng)有性雜交選育手段，缺乏新技術(shù)的應(yīng)用，使苦瓜育種正面臨如何拓寬遺傳背景、深度挖掘重要功能基因資源以提高苦瓜育種效率的瓶頸問題（Dhillon et al.，2016；Cui et al.，2018）。

誘變育種是20世紀(jì)發(fā)現(xiàn)和使用的一種育種新途徑。其中，化學(xué)誘變育種技術(shù)具有使用方便、特異性較強和誘變后代較易穩(wěn)定遺傳等特點，已廣泛應(yīng)用于擬南芥（Kim et al.，2006）、水稻（王峰 等，2011；程欣 等，2013；王平榮 等，2013）、玉米（Lu et al.，2018）、大豆（謝圣男 等，2013）、油菜（李浩杰 等，2012）、辣椒（趙會芳，2005；周書棟 等，2017）和黃瓜（張兵，2012；薛存寶，2016）等各類植物，并且取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。EMS（甲基磺酸乙酯）是一種高效、安全的化學(xué)誘變劑，其在生物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成缺電子的活潑中間產(chǎn)物，容易與堿基上的N原子和磷酸基團(tuán)發(fā)生親核取代反應(yīng)，最終通過堿基或磷酸基團(tuán)的烷基化而使DNA發(fā)生突變，對于突變體庫的構(gòu)建、新種質(zhì)的創(chuàng)制以及基因功能分析具有重要作用（崔霞 等，2013；黃冬福 等，2015）。

EMS誘變效率的高低主要和使用濃度、處理時間、處理時的溫度以及處理材料的組織結(jié)構(gòu)特性等因素密切相關(guān)（劉忠松和羅赫榮，2010）。種子是EMS誘變處理最常用的對象，其優(yōu)點在于操作簡單，便于大量處理，而且無需耗時的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)，便可以在短時間內(nèi)構(gòu)建大量的突變?nèi)后w。前人對許多作物的種子EMS誘變條件進(jìn)行了探索分析，結(jié)果表明多數(shù)作物種子的EMS誘變適宜濃度在0.3%～1.5%之間，誘變時間0.5～24.0 h不等（劉忠松和羅赫榮，2010）。瓜類蔬菜作物中，黃瓜種子的適宜EMS誘變條件為1%濃度處理10 h或1.5%濃度處理8 h（王晶 等，2015），西瓜種子的適宜條件為1%濃度處理9 h（王學(xué)征 等，2015），瓠瓜種子的適宜條件為開殼浸種4 h，然后1.5%濃度處理8 h（康保珊 等，2017）。

本試驗以苦瓜干種子為材料，通過設(shè)置EMS溶液不同濃度和不同誘變時間處理，對處理后的苦瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別進(jìn)行統(tǒng)計和分析，同時對部分處理獲得的苦瓜幼苗進(jìn)行田間定植和表型觀察，確定苦瓜種子EMS誘變的適宜條件，旨在為下一步構(gòu)建苦瓜突變體庫以及創(chuàng)制苦瓜新材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為廣東省江門市農(nóng)家品種江門大頂經(jīng)8代自交獲得的穩(wěn)定自交系苦瓜干種子，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院苦瓜育種課題組提供。EMS原液購自Sigma-Aldrich公司（貨號：M0880）。

1.2 EMS溶液配制

首 先 用 0.2 mol·L-1Na2HPO4和 0.2 mol·L-1NaH2PO4按61∶39的比例（V∶V）混合，再稀釋20倍，獲得0.01 mol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH=7.0）；然后按體積百分比配制濃度分別為0（即緩沖液）、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%的EMS溶液。

1.3 誘變處理

考慮到苦瓜種子的適宜浸種時間一般為10～12 h，因此將不同濃度EMS溶液誘變處理苦瓜種子時間設(shè)置為2、4 h和6 h。具體誘變程序如下：2018年3月31日，首先選取顆粒飽滿的苦瓜種子分為3份，分別進(jìn)行30 ℃清水浸種4、6 h和8 h處理，然后用吸水紙吸干種子表面水分，用不同濃度EMS溶液相應(yīng)地分別浸種6、4 h和2 h，即清水和不同濃度EMS溶液累計浸種10 h。共計18個處理，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)50粒種子。以30 ℃清水浸種10 h作為對照（CK）。

1.4 育苗試驗

處理完成后將種子取出，用自來水流動沖洗1 h，輕微甩干，然后將各處理種子播種到5×10穴裝有育苗基質(zhì)的穴盤進(jìn)行發(fā)芽試驗。從播種第2天開始，連續(xù)21 d每天上午8：00～10：00記錄種子萌發(fā)情況，統(tǒng)計發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)：

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel和SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和統(tǒng)計作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EMS溶液和不同誘變時間處理苦瓜種子的萌發(fā)動態(tài)

通過每天觀察記錄穴盤中苦瓜種子破土萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)從播種后第11天各處理苦瓜種子陸續(xù)開始破土萌發(fā)，最早（即第11天）萌發(fā)的有0濃度處理2 h、0.9%濃度處理6 h和對照（圖1）。至播種后第15天，所有處理苦瓜種子都已開始萌發(fā)。播種后第16和17天是各處理苦瓜種子的萌發(fā)高峰期，之后趨于平穩(wěn)（圖1）。方差分析結(jié)果表明，不同濃度EMS溶液和不同誘變處理時間對苦瓜種子無論是起始萌發(fā)時間還是萌發(fā)高峰期影響都不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同濃度EMS溶液和不同誘變時間處理苦瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

由于大部分經(jīng)處理的苦瓜種子萌發(fā)高峰期都集中在播種后第16天，所以選擇第16天的萌發(fā)數(shù)據(jù)計算苦瓜種子的發(fā)芽勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組發(fā)芽勢最高，平均為52.7%。除0濃度2 h、0.6%濃度2 h和0.9%濃度6 h 3個處理以外，其他處理的苦瓜種子發(fā)芽勢與對照組相比都顯著下降（P＜0.05，圖2-a）。1.5%濃度4 h、1.5%濃度6 h和1.2%濃度4 h 3個處理的相對發(fā)芽勢分別為5.1%、7.6%和7.6%（圖2-b），表明高濃度EMS處理可顯著抑制苦瓜種子的發(fā)芽勢。在相同濃度EMS溶液處理條件下，除0.9%濃度以外，其他濃度2 h處理的發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢均高于4 h或6 h處理。0濃度和0.6%濃度處理條件下，4 h處理的發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢均高于6 h處理，0.3%、0.9%、1.2%、1.5%濃度處理則相反（圖2-a、2-b），表明EMS溶液濃度和誘變處理時間可能存在互作。

圖1 不同濃度EMS溶液和不同誘變時間處理苦瓜種子的萌發(fā)動態(tài)

統(tǒng)計播種后第21天種子發(fā)芽情況，發(fā)現(xiàn)對照組苦瓜種子發(fā)芽率最高，平均為81.3%。0濃度2 h、0.3%濃度6 h、0.6%濃度2 h 和4 h、0.9%濃度6 h共5個處理的發(fā)芽率與對照組差異不顯著（P＞0.05）。使用高濃度（1.2%和1.5%）EMS處理時，誘變時間無論是2、4 h還是6 h，發(fā)芽率都顯著下降（圖2-c）。其中，經(jīng)EMS 1.5%濃度4 h和1.2%濃度4 h處理后的苦瓜種子發(fā)芽率下降最多，相對發(fā)芽率都僅為23.8%（圖2-d）。使用0濃度和0.6%濃度處理時，苦瓜種子的發(fā)芽率和相對發(fā)芽率隨誘變時間增加而降低；使用0.3%濃度和0.9%濃度處理時，其發(fā)芽率和相對發(fā)芽率隨誘變時間增加而升高；使用高濃度（1.2%和1.5%）處理時，其發(fā)芽率和相對發(fā)芽率由高到低的順序都是2 h＞6 h＞4 h。經(jīng)EMS處理后的苦瓜種子發(fā)芽率與其發(fā)芽勢基本類似，與誘變時間并非完全呈線性相關(guān)，再次說明EMS溶液濃度和誘變處理時間可能存在互作。

圖2 不同濃度EMS溶液和誘變時間處理苦瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

2.3 苦瓜種子EMS誘變適宜濃度和誘變時間條件分析

對不同濃度EMS溶液和不同誘變時間處理的苦瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率進(jìn)行雙因素方差分析。結(jié)果表明，EMS濃度、誘變時間以及兩者之間的互作對苦瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05，表1），因此在開展苦瓜種子EMS誘變時，必須綜合考慮EMS濃度和誘變時間對誘變效果的影響。由于苦瓜種子相對發(fā)芽率最接近50%的處理為EMS 1.5%濃度處理2 h（圖2-d），按照半致死條件即為適宜誘變條件的原則，認(rèn)為先用清水浸種8 h，然后用1.5%濃度EMS溶液處理2 h是苦瓜種子EMS誘變的適宜條件。此外，1.2%濃度EMS溶液處理2 h的相對發(fā)芽率（56.6%）也比較接近50%（圖2-d），亦可認(rèn)為是苦瓜種子EMS誘變的比較適宜的條件。

表1 不同濃度EMS溶液和誘變時間處理的苦瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率方差分析結(jié)果

圖3 苦瓜M0部分突變體幼苗和果實表型變異

為了驗證所篩選處理條件的誘變效果，將1.2%和1.5%濃度EMS溶液處理2 h所獲得的苦瓜幼苗（M0，共129株）定植到大田，于苗期至開花結(jié)果期進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.2%濃度和1.5%濃度EMS處理2 h的表型突變頻率分別為5.12%和7.85%，且表型變異主要集中在苦瓜葉片和果實（圖3），表明本試驗所篩選的誘變條件可以用于苦瓜種子EMS誘變研究。

3 結(jié)論與討論

EMS誘變是突變效率較高且比較主流的一種化學(xué)誘變方法，對于突變體庫的構(gòu)建以及新種質(zhì)的創(chuàng)制具有重要的作用，但其在苦瓜上的應(yīng)用未見報道。明確EMS誘變適宜的條件是開展EMS誘變育種研究的前提。本試驗首次以苦瓜干種子為材料，通過不同濃度EMS溶液和不同誘變時間處理組合對苦瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率影響的試驗以及M0表型鑒定觀察，明確了先用清水浸種8 h，然后用1.5%或者1.2%濃度EMS溶液處理2 h是苦瓜種子EMS誘變的適宜條件。與其他已經(jīng)報道的黃瓜和西瓜等瓜類作物的誘變條件相比，苦瓜種子對EMS溶液響應(yīng)的起始濃度偏高，這可能與苦瓜種子較大且種皮結(jié)構(gòu)較厚有關(guān)；另外，苦瓜種子EMS溶液處理所需時間比前人報道的其他瓜類作物都要短（王晶等，2015；王學(xué)征 等，2015；康保珊 等，2017），這可能與EMS處理前利用清水提前浸種8 h而使苦瓜種皮通透性發(fā)生改變有關(guān)?？喙戏N子EMS誘變適宜條件的確定，為下一步利用EMS誘變技術(shù)開展苦瓜誘變育種相關(guān)研究提供了重要參考。

苦瓜作為華南特色瓜類蔬菜作物之一，其基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究越來越受到重視。種質(zhì)資源是開展各類研究的首要前提，前人已經(jīng)通過調(diào)查引種、有性雜交和物理誘變等各種途徑（陳小鳳 等，2011；黃亞杰 等，2012；黃如葵 等，2015），一定程度上豐富了苦瓜資源的遺傳背景。然而，由于苦瓜并非我國原產(chǎn)，國內(nèi)遺傳資源相對匱乏，使苦瓜育種仍面臨如何拓寬遺傳背景的實際問題。近年來，隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，苦瓜全基因組序列已經(jīng)相繼被日本和中國研究者破解（Urasaki et al.，2017；Cui et al.，2018），標(biāo)志著苦瓜基因組學(xué)研究也已經(jīng)邁向功能/后基因組學(xué)時代。利用EMS誘變技術(shù)構(gòu)建苦瓜突變體庫結(jié)合全基因組重測序或簡化基因組測序等手段（Abe et al.，2012），可以快速確定苦瓜突變基因以及明確其功能，對于苦瓜分子育種以及深入闡釋控制苦瓜重要農(nóng)藝性狀基因的分子機理具有重要意義。