龔雪，李柱，張娜，王杰，韓奇亨，任凱，張春紅，3，4*，李旻輝，3，4，5，6*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.額濟(jì)納旗蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 阿拉善盟 735400；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)特色道地藥材資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014060；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；6.廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023)

胡楊PopulusdiversifoliaSchrenk.為楊柳科楊屬植物，產(chǎn)于我國內(nèi)蒙古西部、新疆、甘肅、青海。國外分布在蒙古、蘇聯(lián)(中亞部分和高加索)、埃及、敘利亞、印度、伊朗、阿富汗、巴基斯坦等地[1]。樹脂入藥，味苦、咸，性寒。具有清熱解毒，制酸止痛的功效。用于咽喉腫痛，牙痛，淋巴結(jié)結(jié)核，胃、十二指腸潰瘍，胃痛，胃酸過多；外用治中耳炎，痔瘡[2]。該傳統(tǒng)應(yīng)用表明其功效可能與抗炎作用有關(guān)。故本研究以脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，采用胡楊樹脂提取物處理炎癥模型，對胡楊樹脂提取物進(jìn)行活性篩選，探討胡楊樹脂提取物對細(xì)胞的抗炎效果。同時(shí)，本研究利用UPLC-Q-Exactive 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)，對胡楊樹脂的化學(xué)成分快速識(shí)別和鑒定[3-5]。以期為胡楊樹脂的抗炎活性及化學(xué)成分研究奠定基礎(chǔ)，為胡楊樹脂的臨床應(yīng)用及綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

胡楊樹脂采于內(nèi)蒙古阿拉善盟額濟(jì)納旗，經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院李旻輝教授鑒定為楊柳科植物胡楊PopulusdiversifoliaSchrenk.的樹脂。

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，Sigma公司)；DMSO和青霉素、鏈霉素(?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，sigma公司)。

甲酸、乙腈、異丙醇(色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；超純水(沈陽欣潔科技有限公司)。

1.2 儀器

Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；SW-CJ超凈臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；XDS-1B倒置顯微鏡(上海比目儀器廠)；Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo公司)；臺(tái)式離心機(jī)(Thermo公司)。

UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Thermo公司)；Thermo Scientific Accucore aQ 色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm，Thermo公司)；BT125D十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DS2510DT超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣品的制備

胡楊樹脂提取物制備：稱取胡楊樹脂粉末250 g，采用超聲提取法，用正丁醇超聲提取3次(正丁醇用量為2000 mL、2000 mL、1500 mL)，合并提取液濃縮至干。殘?jiān)铀芙?，用正丁醇萃取，將萃取液濃縮至干，即得胡楊樹脂提取物。

胡楊樹脂提取物樣品：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，將胡楊樹脂提取物用超純水配成200 mg·mL-1的母液，再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

胡楊樹脂供試品：稱取胡楊樹脂提取物150 mg，加異丙醇1 mL，超聲60 min，離心后取上清，過0.45 μm濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用分析。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7用含10%胎牛血清，100 mg·mL-1青霉素，100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[6]。

2.3 胡楊樹脂提取物對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

RAW 264.7細(xì)胞按每毫升1×105個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg·mL-1)的胡楊樹脂提取物樣品。同時(shí)設(shè)空白對照(未加胡楊樹脂提取物)，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)，根據(jù)公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率[7-8]。

(1)

2.4 胡楊樹脂提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

取對數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞按1×105個(gè)·mL-1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg·mL-1)的胡楊樹脂提取物樣品，保護(hù)4 h后加入終濃度為1 μg·mL-1的LPS。設(shè)空白對照組、LPS組，LPS+胡楊樹脂提取物組，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，培養(yǎng)20 h后，每孔加入新配制的5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)。

2.5 色譜及質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：Thermo Scientific Accucore aQ (2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B)，梯度洗脫見表1；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫色譜條件

質(zhì)譜條件：離子源為HESI源，正離子檢測模式，鞘氣壓力206.84 kPA；輔助氣體積流量15.22 L·min-1；噴霧電壓3.5 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式Full MS/dd-MS2，full MS分辨率70 000；dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1500。MS/MS時(shí)，碰撞能40 eV。

3 結(jié)果

3.1 胡楊樹脂提取物對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測胡楊樹脂提取物對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，與空白組比較，胡楊樹脂提取物不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg·mL-1)對RAW 264.7細(xì)胞的增殖作用無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)胡楊樹脂提取物對細(xì)胞增殖無影響，無細(xì)胞毒性作用(圖1)。

圖1 胡楊樹脂提取物對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

3.2 胡楊樹脂提取物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

與LPS模型組比較，濃度為12.5、25、50、100、200 μg·mL-1胡楊樹脂提取物能顯著改善LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的炎癥反應(yīng)，具有較好的濃度依賴性(P<0.05)，表明該濃度下的胡楊樹脂提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥具有較好的保護(hù)活性(圖2)。

注：與空白對照組比較，***表示P<0.001；與LPS組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。圖2 胡楊樹脂提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

3.3 化合物質(zhì)譜分析

供試品溶液按2.1項(xiàng)中質(zhì)譜條件進(jìn)行分析檢測后，利用TraceFinder 軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理。將全掃描模式的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MassFrontier 7.0軟件進(jìn)行分析，推導(dǎo)其可能的結(jié)構(gòu)式。再將檢測到的化合物的精確分子量試驗(yàn)值與理論值進(jìn)行匹配，在Compound Discoverer 2.1軟件自帶的數(shù)據(jù)庫mzCloud、中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫、Chemspider及Scifinder等進(jìn)行檢索，并結(jié)合化合物的一級、二級質(zhì)譜及裂解規(guī)律進(jìn)行分析和鑒定，推測鑒定出6個(gè)化合物。胡楊樹脂(+)ESI-MS的質(zhì)譜基峰離子流圖見圖3，已推測鑒定的各化合物保留時(shí)間、質(zhì)譜信息見表2。

注：1棕櫚油酸；2鄰苯二甲酸二丁酯；3十六酰胺；4油酸酰胺；5硬脂酰胺；6芥酸酰胺。圖3 胡楊樹脂UPLC-Q-Exactive MS 的正離子質(zhì)譜基峰離子流圖

峰號保留時(shí)間/min準(zhǔn)離子峰[M+H]+分子式二級碎片(m/z)化合物122.68255.23C16H30O2327.22,219.21,167.14棕櫚油酸224.49279.15C16H22O4205.08,149.02鄰苯二甲酸二丁酯330.00256.26C16H33NO116.10,88.07,57.07十六酰胺430.28282.27C18H35NO226.21,170.15油酸酰胺533.92284.29C18H37NO116.10,102.09,88.07,74.06硬脂酰胺637.02338.34C22H43NO282.27,149.02芥酸酰胺

3.4 棕櫚油酸及十六酰胺結(jié)構(gòu)解析

本實(shí)驗(yàn)主要對胡楊樹脂中具有抗炎活性的化合物進(jìn)行分析，通過高分辨質(zhì)譜及二級質(zhì)譜的碎片離子推測化合物結(jié)構(gòu)式[3]，在此，以化合物1、3舉例進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

化合物1：棕櫚油酸。結(jié)合正離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z255.23[M+H]+，推斷此化合物的分子式為C16H30O2，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z327.22、219.21、167.14，m/z237.22 [M+H-18]+是母離子失去一分子水，m/z219.21 [M+H-36]+是母離子失去兩分子水，m/z167.14 [M+H-88]+是母離子失去C5H11O(圖4)，結(jié)合文獻(xiàn)推測此化合物為棕櫚油酸[9-10]。

圖4 化合物1提取離子質(zhì)譜圖

化合物3：十六酰胺。結(jié)合正離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z256.26[M+H]+，推斷此化合物的分子式為C16H33NO，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z116.10、88.07、57.07，m/z116.10 [M+H-140]+是母離子失去C10H20，m/z88.07 [M+H-168]+是母離子失去C12H24，m/z57.07 [M+H-199]+是母離子失去C12H25NO(圖5)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行匹配，推測此化合物為十六酰胺。

圖5 化合物3提取離子質(zhì)譜圖

4 討論

胡楊樹脂，又名胡楊淚、胡楊堿，為胡楊樹干的分泌物?！侗静菥V目》載：“胡楊淚，胡楊樹脂也，故名淚”。具有清熱解毒，制酸止痛的功效。主治咽喉腫痛，牙痛，淋巴結(jié)結(jié)核，胃、十二指腸潰瘍，胃痛，胃酸過多；外用治中耳炎，痔瘡。但是，迄今為止其化學(xué)成分和藥理活性的系統(tǒng)研究基本處于空白。因此，有必要對胡楊樹脂進(jìn)行系統(tǒng)研究，以充分利用胡楊的藥用價(jià)值。

本研究基于胡楊樹脂的傳統(tǒng)功效，探討其抗炎活性。利用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7構(gòu)建炎癥模型，采用MTT法對胡楊樹脂進(jìn)行活性篩選，結(jié)果表明胡楊樹脂在12.5、25、50、100、200 μg·mL-1濃度下具有顯著改善LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)的作用，且表現(xiàn)出較好的濃度依賴性。同時(shí)，本研究利用UPLC-Q-Exactive 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)，對胡楊樹脂的化學(xué)成分快速識(shí)別和鑒定推測出6個(gè)化合物。其中的化合物1推測鑒定為棕櫚油酸，棕櫚油酸是一種ω-7單不飽和脂肪酸，可以調(diào)節(jié)身體代謝，影響炎癥標(biāo)記物和 PPAR代謝通路，對炎癥有一定的治療效果[11-13]；化合物3推測鑒定為十六酰胺，十六酰胺已被證明可與細(xì)胞核的一種受體(核受體)結(jié)合，對于多種慢性疼痛和炎癥相關(guān)的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。此外，化合物4油酸酰胺及化合物6芥酸酰胺為不飽和脂肪酸酰胺類化合物，有研究通過采用DPPH-HPLC方法證明了油酸酰胺和芥酸酰胺具有抗氧化的生物活性[14]。且有發(fā)明從圓錐鐵線蓮中分離得到一種酰胺類化合物金色酰胺醇酯，初步體外藥理研究發(fā)現(xiàn)此酰胺類活性成分具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[15]。故推測胡楊樹脂的抗炎活性可能與以上成分有關(guān)。

本研究結(jié)果為胡楊樹脂化學(xué)成分的分離提取及其藥理作用奠定基礎(chǔ)，為胡楊樹脂的臨床應(yīng)用及綜合開發(fā)提供參考資料。但對于胡楊樹脂的生理活性、有效成分及相關(guān)作用機(jī)制等還需進(jìn)行深入的研究與調(diào)查。