謝苗苗，肖柳，楊磊，楊全偉

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3.武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430000)

金釵石斛是寶貴的食藥兩用藥物，化學(xué)成分主要有多糖類、生物堿類和酚類等[1-2]，其中多糖為主要成分之一[3-5]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，金釵石斛多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗炎和抗氧化等功能[6-7]，引起了眾多專家學(xué)者的關(guān)注。文中通過研究金釵石斛多糖的分離純化工藝及抗衰老生物活性，在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中，氧化應(yīng)激是重要損傷機(jī)制。肝細(xì)胞受損后產(chǎn)生的過量活性氧自由基，攻擊生物膜，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，使過氧化物水平增高，引起細(xì)胞中毒，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-9]。利用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷，研究多糖的抗衰老作用，為金釵石斛多糖的開發(fā)應(yīng)用提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥材與試劑：金釵石斛Dendrobiumnobile購自北京同仁堂有限公司，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201502)，葡聚糖Dextran T-(末端-)2 000、T-700、T-580、T-500、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3 和 T-4(瑞典 Pharmacia 公司)，二乙氨乙基纖維素(DEAE-Cellulose)，透析袋(分子截留為相對(duì)分子質(zhì)量3500，上海綠鳥公司)，MTT(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone，Thermo scientific，USA)；馬血清；新生小牛血清；PBS，CAPE，30%過氧化氫均等試劑購自國(guó)藥試劑有限公司，均為分析純。

儀器與設(shè)備：B5-1磁力攪拌器、BSZ-100 自動(dòng)部分收集器和 HL-2 恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)，Beckman高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；752N 紫外可見分光光度計(jì)(上海精科儀器有限公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo 公司)；倒置顯微鏡(美國(guó)Thermo 公司)；分析天平(上海精科儀器有限公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司)。Agilent 1260 Series 高效液相系統(tǒng)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)，RE-201D恒溫水浴鍋(上海普渡生化科技有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 金釵石斛多糖的制備

金釵石斛藥材取500 g，加入10倍體積95%乙醇脫脂，干燥后用15倍體積水回流提取，提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至適量體積后，離心，上清液用流動(dòng)水透析2 d，除去色素和無機(jī)鹽等。然后將透析袋內(nèi)液濃縮至約1 L，離心后取上清液用3倍體積95%乙醇于4 ℃下進(jìn)行冷凍沉淀，靜置24 h，離心。沉淀物用無水乙醇洗滌3次后，于60 ℃真空干燥器中干燥，得到金釵石斛水提粗多糖。

2.2 DEAE-52纖維素柱純化

2.2.1 多糖純化 將所得多糖溶于蒸餾水中，制成濃度為20 mg·mL-1的溶液，利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱(50 cm×5 cm)進(jìn)行分離，硫酸-苯酚法490 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)，合并洗脫液，濃縮至小體積后對(duì)去離子水透析，冷凍干燥后得到純化金釵石斛多糖DNPL。

2.2.2 多糖純度檢查 取適量經(jīng)過DEAE纖維素柱分離純化的多糖， 配成1 mg·mL-1的多糖溶液， HPGPC上樣，色譜柱為Sephadex G-100凝膠柱，記錄出峰的色譜曲線。觀察曲線是否為形態(tài)對(duì)稱， 單一峰形。

2.2.3 金釵石斛多糖的中性糖含量測(cè)定 稱取200 mg烘至恒重的葡萄糖，蒸餾水定容至 100 mL為母液，吸取10 mL母液定容至100 mL為工作液，搖勻，準(zhǔn)確吸取工作液0、0.2、0.4、0.6、 0.8、1.0 mL于10 mL具塞試管，用水定容至1 mL，加入苯酚溶液0.4 mL，搖勻后再濃硫酸5 mL，搖勾，冰浴冷卻至常溫后，沸水浴煮沸10 min后，冷至室溫，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。再精密稱取金釵石斛多糖50 mg，用蒸餾水溶解，于50 mL容量瓶中定容，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，取1mL樣液于10 mL具塞試管中，加入苯酚溶液0.4 mL，搖勻后再濃硫酸5 mL，搖勾，冰浴冷卻至室溫后，沸水浴煮沸10 min，再冷卻至室溫，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出金釵石斛多糖的中性糖含量。

2.2.4 金釵石斛多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 采用HPGPC法測(cè)定金釵石斛多糖的分子量。分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran T-(末端-)2000、T-700、T-580、T-500、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3和 T-4各5 mg，用1 mL的蒸餾水溶解后，離心，上樣，色譜柱為Sephadex G-100凝膠柱，流動(dòng)相為0.1 mol·L-1NaNO3，流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，柱溫40 ℃。另取多糖樣品5 mg，加蒸餾水1 mL(濃度為5 mg·mL-1)、離心、取上清液，按上述洗脫條件進(jìn)行分離，測(cè)定洗脫體積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出多糖組分的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.3 多糖的配置

釵石斛多糖用PBS緩沖液配置成10 mg·mL-1的儲(chǔ)存液，后用完全培養(yǎng)基稀釋的工作濃度進(jìn)行細(xì)胞處理。

2.4 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HepG2細(xì)胞株由ATCC所提供，保存于液氮中，用含10%胎牛清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于37 ℃飽和濕度、含5%CO2和95%空氣的恒溫箱中培養(yǎng)，直接吹打無需胰蛋白酶消化傳代，待細(xì)胞傳至10～20代時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)[6]。

2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活力

HepG2細(xì)胞1×104cells/mL的細(xì)胞懸液，以每孔50 μL接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后，加入樣品繼續(xù)培養(yǎng)24 h(濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、0 μg·mL-1)，加入含終濃度為5 mg·mL-1的MTT的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL 裂解液，待結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)存活率[11-13]。

2.6 H2O2誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞損傷模型的建立

HepG2細(xì)胞以1.5×104細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，貼壁24 h后給予多糖處理，濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、0 μg·mL-1，給藥2 h后給予800 uM過氧化氫處理，處理期間全程給藥，空白對(duì)照組比較。設(shè)置陽性參照物為CAPE 。

過氧化氫處理2 h后，每孔加入MTT后使其終濃度為0.5 mg·mL-1，37 ℃孵育4 h 后，每孔加入100 μL裂解液，待結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

2.7 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

肝癌HepG2細(xì)胞以每瓶1.6×106cells接種于12孔板培養(yǎng)過夜，不同實(shí)驗(yàn)濃度的樣品溶液處理24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并進(jìn)行照相。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 金釵石斛多糖的分離純化

將上述實(shí)驗(yàn)所得到金釵石斛多糖，測(cè)得金釵石斛水提粗多糖得率為8.36%。金釵石斛粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離純化后，根據(jù)蒸餾水洗脫所得純化金釵石斛多糖DNPL，得率5.32%。

3.2 金釵石斛多糖DNPL的純度、中性糖含量和相對(duì)分子質(zhì)量分析

根據(jù)圖1所示金釵石斛粗多糖的HPGPC結(jié)果，可觀察到多糖組分的洗脫曲線形態(tài)對(duì)稱， 峰形單一， 表明其純度較好，純度達(dá)到了100%， 分子量分布較為均一。

圖1 金釵石斛多糖高效凝膠色譜圖

根據(jù)作得中性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=13.034X+0.132 8(r=0.997 1)，其中Y為吸光度，X為濃度(mg·mL-1)，根據(jù)金釵石斛粗多糖吸光度為0.912，計(jì)算得金釵石斛多糖DNPL中性糖含量為68.58%

金釵石斛粗多糖的HPGPC結(jié)果見圖1，根據(jù)所作標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=-0.319 4X+12.189(r=0.996 9)，其中Y為相對(duì)分子質(zhì)量取以10為底的對(duì)數(shù)值，X為保留時(shí)間。由于HPLC檢測(cè)使用的是示差檢測(cè)器，倒峰為流動(dòng)相溶劑的峰。根據(jù)金釵石斛粗多糖的保留時(shí)間24.234 min計(jì)算得金釵石斛多糖DNPL的平均相對(duì)分子質(zhì)量2.8×104Da。

3.3 金釵石斛多糖DNPL對(duì)H2O2 誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞保護(hù)作用的影響

過氧化氫H2O2進(jìn)入HepG2肝癌細(xì)胞后可形成高活性的自由基，引起脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞衰老。結(jié)果表明，HepG2在H2O2作用下的細(xì)胞存活率為78.30%，與空白對(duì)照組比較具有顯著性，表明造模成功；DNPL在濃度31.25、62.5、500、1000 μg·mL-1的作用下，存活率分別為65.70%、72.40%、74.60%、75.60%、90.70%、107.80%。金釵石斛多糖DNPL在濃度為1000 μg·mL-1時(shí)對(duì)HepG2在H2O2作用下的細(xì)胞存活率最大。金釵石斛多糖DNPL對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，隨濃度的升高抗氧化作用增強(qiáng)，并且在濃度高于500 μg·mL-1后強(qiáng)于陽性參照CAPE的抗氧化作用，具有顯著性，金釵石斛多糖可能具有明顯的抗細(xì)胞衰老的作用[8]。

3.4 金釵石斛多糖DNPL對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)影響

HepG2細(xì)胞是一種與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有同源性的肝癌細(xì)胞。結(jié)果表明(表1)，金釵石斛多糖直接對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2沒有明顯抑制生長(zhǎng)作用，僅在濃度為1000 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞存活率分別為67.1%，顯示其有輕度的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

表1 MTT法檢測(cè)金釵石斛多糖DNPL處理的細(xì)胞存活力

3.5 金釵石斛多糖(DNPL)對(duì)H2O2 誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

過氧化氫H2O2進(jìn)入HepG2肝癌細(xì)胞后可形成高活性的自由基，引起DNA損傷，脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞形態(tài)變化。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，根據(jù)氧自由基清除及抗H2O2損傷記過對(duì)金釵石斛多糖DNPL觀察對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)變化影響。與正常細(xì)胞對(duì)照組比，金釵石斛多糖DNPL及陽性參照組細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常。

圖2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化(×10倍)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選取金釵石斛為原料，通過水提醇沉獲得粗多糖，然后經(jīng)過DEAE-52柱色譜進(jìn)行分離純化，蒸餾水洗脫獲得純化金釵石斛多糖DNPL。對(duì)金釵石斛多糖的中性糖含量進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明中金釵石斛粗多糖的中性糖含量為68.58%，相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×104Da。由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，尚未對(duì)此多糖進(jìn)一步純化和對(duì)精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步討論，接下來本課題組擬通過糖組成分析部分酸水解、完全酸水解，酶解，紅外和核磁共振等分析方法進(jìn)行深入研究。

通過對(duì)金釵石斛多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明金釵石斛多糖DNPL在濃度為1000 μg·mL-1時(shí)對(duì)HepG2在H2O2作用下的細(xì)胞存活率最大。隨濃度的升高抗氧化作用增強(qiáng)，并且在濃度高于500 μg·mL-1后強(qiáng)于陽性參照CAPE的抗氧化作用，金釵石斛多糖具有明顯的抗細(xì)胞衰老的作用。