線紋海馬Hippocampus erectus的tlr21基因結(jié)構(gòu)及其對(duì)CpG-ODN的應(yīng)答特征

2019-01-16 07:17:32張媛秦耿張博林強(qiáng)

熱帶海洋學(xué)報(bào) 2019年1期

張媛, 秦耿, 張博, 林強(qiáng)

線紋海馬的基因結(jié)構(gòu)及其對(duì)CpG-ODN的應(yīng)答特征

張媛1, 2, 秦耿1, 張博1, 2, 林強(qiáng)1, 2

1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

作為先天性免疫反應(yīng)中重要的模式識(shí)別受體之一,(toll-like receptor)基因家族介導(dǎo)的先天性免疫是脊椎動(dòng)物抵御病原微生物的重要防線。研究分析了線紋海馬基因的序列特征, 并基于抗原注射實(shí)驗(yàn)探討了海馬的免疫功能。線紋海馬基因的開放閱讀框長度為2946bp, 編碼981個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)其編碼蛋白相對(duì)分子量為246.98kDa, 理論等電點(diǎn)為4.78。編碼蛋白主要包含1個(gè)信號(hào)肽和3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域: 胞外區(qū)具有14個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域(LRR), 跨膜區(qū)具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域, 胞內(nèi)區(qū)則具有TIR結(jié)構(gòu)域。同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 線紋海馬基因與虎尾海馬基因的同源性最高, 其次與斜帶石斑魚、牙鲆、大菱鲆和紅鰭東方鲀的基因聚為一枝?；蛟诰€紋海馬的腦、鰓、肝、腸、腎、性腺、肌肉和育兒袋各組織均有分布, 腎臟中表達(dá)量最高?？乖⑸鋵?shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 線紋海馬Tlr21對(duì)不同類型CpG寡脫氧核苷酸(CpG-ODNs)的識(shí)別能力存在差異, 其中, CpG-2007和CpG-HC4040對(duì)海馬腎臟的mRNA表達(dá)量具有顯著的促進(jìn)作用(＜0.05)。研究表明線紋海馬Tlr21能夠通過識(shí)別含CpG序列的DNA發(fā)揮免疫識(shí)別作用, 研究結(jié)果將有助于系統(tǒng)認(rèn)識(shí)海馬免疫系統(tǒng)中家族基因的功能特征, 為建立海馬病害防治策略提供理論依據(jù)。

; 基因結(jié)構(gòu); CpG-ODN; 免疫; 線紋海馬; 組織表達(dá)差異

Toll樣受體(TLR, toll-like receptor)是先天性免疫反應(yīng)中重要的模式識(shí)別受體之一。TLR介導(dǎo)的先天性免疫是脊椎動(dòng)物抵御病原微生物的第一道防線, 其在連接先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)過程中起著非常重要的橋梁作用(Janeway et al, 2012)?；蚓幋a的蛋白富含亮氨酸重復(fù)序列的功能域(leucine-rich repeats, LRR)能夠特異性地識(shí)別不同類型的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP), 例如, 蛋白、糖類、脂質(zhì)、核酸及這些生物大分子的衍生物(O’Neill et al, 2013)。TLR通過胞內(nèi)區(qū)TIR(toll/interleukin-l receptor domain, TIR)結(jié)構(gòu)域和含有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接分子, 如髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene, Myd88)激活下游信號(hào)通路, 啟動(dòng)細(xì)胞因子表達(dá)等宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)(Palti, 2011)。

基因家族在哺乳動(dòng)物中非常保守, 人類有10個(gè)基因家族成員, 鼠有13個(gè)(Kawai et al, 2010; Moresco et al, 2011)。魚類基因種類比哺乳動(dòng)物具有更高的多樣性。大多數(shù)硬骨魚具有22種相對(duì)保守的基因(Takano et al, 2010; Quiniou et al, 2013), 其中包含和等魚類和哺乳動(dòng)物共有基因家族成員(Hwang et al, 2011; Wang et al, 2015)。同時(shí), 魚類基因表現(xiàn)出獨(dú)特的進(jìn)化特征, 例如, 除了斑馬魚等少數(shù)魚類, 絕大多數(shù)魚類缺失基因(Meijer et al, 2004); 大西洋鱈魚的基因家族則發(fā)生顯著變異,、、和基因丟失, 而、、、和基因發(fā)生顯著擴(kuò)張(Sundaram et al, 2012)。

細(xì)菌DNA是病原細(xì)菌的主要成分之一, 其中CpG-DNA是廣泛存在于細(xì)菌、病毒和無脊椎動(dòng)物DNA中具有免疫活性的較短的核苷酸序列(Krieg et al, 1995; Sato et al, 1996)。目前已確定TLR9與TLR21能夠特異性識(shí)別CpG DNA, 哺乳動(dòng)物只有TLR9, 能夠特異性識(shí)別細(xì)菌CpG-DNA(Oshiumi et al, 2003); 鳥類缺失TLR9, 由TLR21替代TLR9特異性識(shí)別CpG-DNA(Hemmi et al, 2000; Keestra et al, 2010); 斑馬魚中同時(shí)存在Tlr9和Tlr21, 兩者都能夠特異性識(shí)別CpG-DNA, 但Tlr9能夠識(shí)別更多類型的CpG DNA, 而Tlr21對(duì)特定結(jié)構(gòu)的GpG DNA識(shí)別能力更強(qiáng)(Yeh et al, 2013)。

Tlr21最早發(fā)現(xiàn)于紅鰭東方鲀中, 之后在兩棲類(Ishii et al, 2007)、鳥類(Temperly et al, 2008)和其他魚類(Sundaram et al, 2012; Wang et al, 2013; Li et al, 2017)中都發(fā)現(xiàn)存在Tlr21。TLR21在生物體的各器官組織中廣泛表達(dá), 能夠識(shí)別革蘭氏陰性菌(Reyes-Becerril et al, 2016)、病毒(Yeh et al, 2017)以及原蟲(Li et al, 2012), 并在識(shí)別特定的病原相關(guān)分子模式后產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Tlr21在魚類中的功能已有一些報(bào)道。Tlr21在大菱鲆不同器官廣泛表達(dá), 且在淋巴組織豐富的脾臟和頭腎中表達(dá)量較高, 用聚肌胞苷酸(polyI:C)、大菱鲆紅體病病毒TRBIV和CpG-ODN 2395(5′- TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG -3′)進(jìn)行體內(nèi)感染后, 鰓、頭腎、體腎和肌肉中的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(Li et al, 2017)。斑馬魚的在各組織中均有表達(dá), 腸、脾臟和腎中表達(dá)量最高, 斑馬魚Tlr21能夠廣泛識(shí)別含有特定基序的CpG-ODN, 對(duì)含GTCGTT基序CpG-ODN的反應(yīng)尤為明顯, 表現(xiàn)為在脾臟中表達(dá)量上調(diào), 進(jìn)而引起γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor beta, TNFb)和白細(xì)胞介素1(interleukin-1 , IL-1)的產(chǎn)生(Yeh et al, 2013)。除了腎和脾臟等常見的免疫器官, Tlr21還在魚類骨骼肌中發(fā)揮作用, 奧氏弧菌侵染比目魚, 導(dǎo)致骨骼肌中表達(dá)量顯著升高, 刺激白介素IL-1b產(chǎn)生, 激活NFκB通路, 并產(chǎn)生TNFα(Valenzuela et al, 2017)。

海馬具有獨(dú)特的形態(tài)特征和繁殖行為策略, 是目前進(jìn)化速率最快的一種硬骨魚類(Lin et al, 2016)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)包括海馬在內(nèi)的海龍科魚類的免疫相關(guān)基因與其他魚類明顯不同。形態(tài)學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)海馬的免疫系統(tǒng)存在獨(dú)特的進(jìn)化特征, 比如, 海馬沒有脾臟, 沒有典型的頭腎, 體表裸露, 沒有鱗片和大量黏液包被, 同時(shí)腸系膜中缺乏腸淋巴組織(gut-associated lymphatic tissue, GALT)(Matsunagaet al, 1998)。線紋海馬已經(jīng)成為我國海馬養(yǎng)殖的主要品種, 因此, 對(duì)于更全面認(rèn)識(shí)海馬的免疫系統(tǒng)功能及病害防治研究也尤顯重要。本研究對(duì)線紋海馬的進(jìn)行了克隆與鑒定, 進(jìn)行了序列特征分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析, 并通過開展CpG-DNA腹腔注射實(shí)驗(yàn), 檢測(cè)海馬基因的表達(dá)模式, 對(duì)海馬基因的功能進(jìn)行了探討。本文的研究結(jié)果可以為海馬基因家族及其免疫應(yīng)答作用研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 也對(duì)今后的海馬病害防控、疫苗佐劑篩選等有指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康線紋海馬取自中國科學(xué)院南海海洋研究所深圳海馬養(yǎng)殖基地, 平均體長9.16cm, 平均體重2.75g, 取回后在中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海水養(yǎng)殖平臺(tái)暫養(yǎng)兩周, 期間溶氧充足, 水溫26±1℃, 鹽度為(28±2)‰, 每天投喂兩次冷凍糠蝦飼料(09:00和16:00), 光照周期12h︰12h。

1.2 cDNA合成與tlr21基因克隆

解剖5只健康海馬, 分別取腦、鰓、性腺、肝、腸、腎、肌肉、育兒袋等8種組織, 采用預(yù)冷的2×PBS洗滌3次, 液氮保存。采用TRIzol抽提法(Thermo公司)獲得總RNA。以總RNA為模板, 利用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司)合成cDNA。參照線紋海馬全基因組的參考序列, 使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier 5.0分段設(shè)計(jì)引物(表1), 進(jìn)行PCR克隆, PCR程序?yàn)? 94℃、5min預(yù)變性; 94℃、40s, 53℃、30s, 72℃、45s, 共34個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min, 4℃保存。對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn), 篩選之后送Introvigen公司測(cè)序, 將獲得的序列使用DNAman8進(jìn)行序列比對(duì), 按片段順序進(jìn)行拼接, 獲得全長序列。

1.3 基因特征分析

使用DNAman軟件對(duì)線紋海馬全長序列進(jìn)行分析; 使用Bio-edit進(jìn)行序列多重比對(duì); 用NCBI在線軟件BLAST進(jìn)行同源性比對(duì); 使用NCBI在線軟件ORF finder 預(yù)測(cè)開放閱讀框架; 使用ProtParam Tool預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子量; 使用SMART軟件推測(cè)目的基因的結(jié)構(gòu)域。分析線紋海馬Tlr21與其他物種Tlr21的氨基酸序列, 通過MEGA6.0軟件NJ(neighbor-joining)方法, 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 引物信息

1.4 CpG-ODN注射實(shí)驗(yàn)

CpG-DNA是存在于細(xì)菌、病毒和無脊椎動(dòng)物的DNA中的具有免疫活性的較短的核苷酸序列。人工合成的含CpG基序的寡聚核苷酸(oligonucleotide, ODN)被稱為CpG-ODN。CpG-ODN注射實(shí)驗(yàn)共使用30只海馬, 將實(shí)驗(yàn)用海馬隨機(jī)分成5組, 每組包含6只海馬, 實(shí)驗(yàn)前一天停止投喂。實(shí)驗(yàn)組分別選用CpG-2000、CpG-2006、CpG-2007和CpG-HC4040進(jìn)行海馬腹腔注射, 采用無菌PBS緩沖液溶解, 注射體系為30μL, 藥物劑量為1μg, 對(duì)照組注射等劑量無菌PBS緩沖液。注射48h后取樣, 解剖提取海馬的腎臟組織, 液氮保存。采用TRIzol法提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

實(shí)驗(yàn)所用硫代化CpG-ODN由Introvigen公司合成, 序列信息見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)中所用硫代化修飾CpG-ODNs的序列

注: 易被Tlr21識(shí)別的基序用加粗字體表示。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)克隆獲得的線紋海馬序列設(shè)計(jì)定量引物, 內(nèi)參基因使用肌動(dòng)蛋白()基因(表1)。引物均由上海生工生物科技有限公司合成。按照SYBR? Premix Ex Taq? (TliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa公司)說明書, 用qPCRLightCycler480 (Roche, USA)進(jìn)行熒光定量PCR。PCR程序?yàn)? 95℃、20s預(yù)變性; 95℃、5s, 60℃、30s, 共35個(gè)循環(huán); 反應(yīng)后55℃上升至95℃測(cè)定熔解曲線檢測(cè)反應(yīng)特異性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)結(jié)果采用相對(duì)表達(dá)量的形式, 以2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算(Livak et al, 2001)。使用 Microsoft Excel 2010和SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 所有數(shù)據(jù)最終以M±SD(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)呈現(xiàn), 顯著性差異用值表示,＞0.05表示差異不顯著,＜0.05表示差異顯著,＜0.01表示差異達(dá)到極顯著水平。作圖采用SigmaPlot 12.5( Systat Software Inc.)軟件。

2 結(jié)果

2.1 線紋海馬tlr21基因序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征

線紋海馬的開放閱讀框長度為2946bp, 該閱讀框架編碼的蛋白含981個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為246.98kDa, 理論等電點(diǎn)為4.78。大部分生物TLR21具有兩個(gè)常見的對(duì)CpG-DNA起重要識(shí)別作用的氨基酸殘基: Asp534(D)和Tyr536(Y), 在線紋海馬Tlr21中只具有其中一個(gè)保守的位點(diǎn)Asp444(D)(圖1a)。氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征分析顯示,編碼的蛋白主要由3個(gè)功能區(qū)構(gòu)成: 胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)具有14個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeats, LRR), 跨膜區(qū)(TM)具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域, 胞內(nèi)區(qū)則具有TIR結(jié)構(gòu)域(圖1b)。

圖1 線紋海馬tlr21基因全長核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列與(a)線紋海馬Tlr21蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(b)

起始密碼子和終止密碼子用細(xì)線方框標(biāo)出, 用*表示終止密碼子, 與CpG-DNA結(jié)合有關(guān)的保守氨基酸用紅色方框標(biāo)記, TIR中的保守box用虛線方框標(biāo)記。LRR: 灰色陰影表示, TIR: 綠色, 跨膜區(qū)域: 藍(lán)色, 信號(hào)肽: 紅色

Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences ofin lined seahorse(a) and structure features of Tlr21in(b). Initiation codon and termination codon are marked with thin line boxes. Termination codon is represented by an asterisk. Conserved amino acids related to CpG-DNA recognition are marked with red line box. Three conserved boxes are marked with dotted box. Grey shading represents LRR domain, green shading represents TIR, blue shading represents transmembrane region (TM), and red shading represents signal peptide

2.2 線紋海馬tlr21基因系統(tǒng)進(jìn)化特征

同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示(圖2), 線紋海馬在進(jìn)化過程中比較保守, 與其他硬骨魚類的相似度較高。線紋海馬的與虎尾海馬的聚為一枝, 兩者相似度超過98%。同時(shí), 線紋海馬與斜帶石斑魚、大菱鲆牙鲆的序列同源性都較高, 相似度分別為63%、61%和61%。

圖2 基于NJ法構(gòu)建的線紋海馬tlr21系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 線紋海馬tlr21基因在不同組織中的表達(dá)特征

如圖3所示, 熒光定量PCR結(jié)果表明,在線紋海馬的腦、鰓、肝、腎、腸、性腺、肌肉、育兒袋8種組織中均有表達(dá), 在腎臟中表達(dá)量最高, 在其他組織中分布水平較低。腎臟表達(dá)量為腦的3.2倍, 其次在鰓中高表達(dá), 表達(dá)量約為腦的2倍, 腎臟中表達(dá)量與其他各組織中表達(dá)量的差異水平為極顯著(＜0.001)

圖3 tlr21在線紋海馬不同組織中的表達(dá)特征

樣本容量=5; 星號(hào)**表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(＜0.01)

Fig. 3 Expression ofin different tissues ofSample size=5. The asterisks ** indicate extremely significant difference (＜0.01)

2.4 tlr21在注射CpG-ODN后的差異表達(dá)分析

圖4所示CpG-ODN線紋海馬腹腔注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 含有GTCGTT特征基序的CpG-2007和含有AACGTT的CpG-HC4040注射組的的表達(dá)量與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯上調(diào), 而含有GACGTT特征基序的CpG-2000和含有GTCGTT特征基序的CpG-2006注射組的表達(dá)量降低。經(jīng)單因素方差分析得出, 與PBS對(duì)照組相比, CpG-HC4040注射組1表達(dá)量上調(diào)達(dá)到顯著水平(=0.022,＜0.05), 其他各組與PBS對(duì)照組相比, 表達(dá)量差異不顯著(＞0.05)。CpG-2000注射組的表達(dá)量不足PBS對(duì)照組的1/2(0.46倍), CpG-2006注射組的1表達(dá)量僅為PBS對(duì)照組的1/5。CpG-HC4040組的表達(dá)量水平, 顯著高于CpG-2000和CpG-2006注射組,值分別為0.017和0.016(＜0.05)。其他各注射組間的表達(dá)量差異均未達(dá)到顯著水平(＞0.05)。

圖4 CpG-ODN注射后tlr21在線紋海馬腎臟中的表達(dá)模式

樣本容量=6; 星號(hào)*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(＜0.05)

Fig. 4 Results forexpression ofin kidney tissues after CpG-ODN injection. Sample size=6. The asterisk * indicates significant statistical difference (＜0.05)

3 討論

3.1 線紋海馬tlr21基因序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征

本研究首次從線紋海馬中克隆得到了基因, 并對(duì)其基因序列、編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式和特異性識(shí)別序列刺激下的表達(dá)模式進(jìn)行了初步研究?；蚣易逶谶M(jìn)化過程中十分保守, 本研究克隆得到的線紋海馬基因的開放閱讀框?yàn)?946bp, 編碼蛋白含981個(gè)氨基酸, 蛋白序列長度與其他魚類的類似, 比如, 日本鰻鱺編碼978個(gè)氨基酸, 黃顙魚編碼982個(gè)氨基酸, 石斑魚編碼979個(gè)氨基酸, 而大菱鲆編碼984個(gè)氨基酸。然而, 已報(bào)道的日本鰻鱺等魚類的編碼蛋白分子量通常不高于120kDa, 但本研究發(fā)現(xiàn)海馬編碼蛋白的預(yù)測(cè)分子量為246.98kDa,遠(yuǎn)高于其他魚類(李春艷等, 2017; 王凱倫, 2017; Li et al, 2017)。

基因家族編碼的蛋白主要由3個(gè)典型功能區(qū)構(gòu)成: 胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)通常含有2~25個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的LRR結(jié)構(gòu)域, 能特異性識(shí)別病原微生物保守的PAMP, 向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)。胞外區(qū)在進(jìn)化過程中具有較大的變異性, 從而適應(yīng)不同的配體分子(O’Neill et al, 2013)。LRR通常含有20~43個(gè)氨基酸殘基, 基序分為保守區(qū)和可變區(qū), 保守區(qū)通常為LxxLxLxxNxL或LxxLxLxxCxxL, L為亮氨酸Leu, N為天門冬酰胺Asn, C為半胱氨酸Cys, x為可變氨基酸(Kang et al, 2011)。胞內(nèi)區(qū)是TIR結(jié)構(gòu)域, 是Tlrs與接頭蛋白都具有的高度同源結(jié)構(gòu)域, 功能是募集接頭蛋白, 激活下游信號(hào)通路, 從而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的免疫反應(yīng), 其序列與白細(xì)胞介素1受體1L-1R家族的胞質(zhì)區(qū)序列有高度同源性(Takeda et al, 2003)?；蚣易宓牡鞍踪|(zhì)的TIR結(jié)構(gòu)域中存在3個(gè)保守的Box, 它們?cè)谒恤~類細(xì)胞質(zhì)Tlr9和Tlr21中都是保守的(O’Neill et al, 2003), Box1和Box2主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), Box3則主要參與受體在細(xì)胞內(nèi)的定位(Slack et al, 2000)。Box2 中的P為保守的脯氨酸, 在雞、鼠、紅鰭東方鲀、蟾胡鯰、斑點(diǎn)叉尾鮰以及日本鰻鱺等魚類的Tlr21中都是保守的(Gao et al, 2013; Reyes-Becerril et al, 2016; 李春艷等, 2017)。由本研究的結(jié)果可知, 線紋海馬的Tlr21蛋白具有這3種典型的功能區(qū)域, 具有1個(gè)信號(hào)肽、14個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域, 與其他魚類的Tlr21結(jié)構(gòu)類似, 并且保留了LRR和TIR中的特征基序和保守氨基酸位點(diǎn), 線紋海馬的Tlr21 在Box2區(qū)域與其他物種同樣保守, 表明其病原體識(shí)別功能及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能與其他魚類的Tlr21相似(O’Neill et al, 2013)。同時(shí), 人類TLR9有2個(gè)保守的氨基酸Asp535(D)和Tyr536(Y), 參與與CpG-DNA的相互作用(Brownlie, 2009 Keestra et al, 2010), 這兩個(gè)氨基酸在斑馬魚Tlr9和Tlr21等一些魚類、非洲爪蟾的TLR21和雞的TLR21中都是保守的(Li et al, 2017)。但本研究發(fā)現(xiàn)線紋海馬與虎尾海馬Tlr21保守位點(diǎn)的絡(luò)氨酸Tyr被苯丙氨酸Phe所替代, 暗示海馬基因功能可能與其他魚類的存在差異。

3.2 線紋海馬tlr21基因的組織表達(dá)特征

根據(jù)已有研究結(jié)果可知,在不同種魚類中的表達(dá)模式不同, 牙鲆在鰓和脾臟組織中表達(dá)量最高(張潔等, 2015), 大西洋鱈魚的則主要在腎、肝、鰓和精巢中表達(dá)(Sundaram et al, 2012)。斑馬魚的在各組織中均有分布, 腸、脾臟和腎中表達(dá)量最高(Yeh et al, 2013)。除了腎和脾臟等常見的免疫器官, 有研究表明, 骨骼肌在魚類免疫也中扮演重要角色, 比目魚的骨骼肌中很高(Valenzuela et al, 2017)。熒光定量PCR結(jié)果顯示,在線紋海馬腦、鰓、肝、腎、腸、性腺、肌肉和育兒袋各組織中均有分布, 在腎和鰓中表達(dá)量最高。海馬的免疫系統(tǒng)存在獨(dú)特的進(jìn)化特征, 比如, 海馬沒有脾臟, 沒有典型的頭腎, 體表裸露, 沒有鱗片和大量黏液包被, 同時(shí)腸系膜中缺乏腸淋巴組織, 腎和鰓是海馬的主要免疫器官(Matsunaga et al, 1998)?？傊? 組織分布結(jié)果表明,主要在海馬腎臟和鰓中高表達(dá), 也暗示其主要在腎臟和鰓組織中發(fā)揮免疫功能。

3.3 線紋海馬Tlr21對(duì)CpG-ODN的應(yīng)答特征

Tlr21能夠廣泛識(shí)別RNA和DNA病毒和細(xì)菌的侵染, 在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。CpG-DNA是存在于細(xì)菌、病毒和無脊椎動(dòng)物的DNA中的具有免疫活性的較短的核苷酸序列。這些序列大多含有以去甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(CpG)構(gòu)成的特定結(jié)構(gòu), 此特定結(jié)構(gòu)即為CpG基序或CpG-DNA。人工合成的含CpG基序的寡聚核苷酸(oligonucleotide, ODN)被稱為CpG-ODN。CpG-ODN能夠激活機(jī)體的Nκ細(xì)胞和巨噬細(xì)胞, 加強(qiáng)IL-6、IL-2、TNF-γ、TNF-α、IFN-1等多種細(xì)胞因子的分泌, 產(chǎn)生炎癥反應(yīng), 能夠增強(qiáng)非特異性免疫反應(yīng)(Yeh et al, 2013)。因此, CpG-ODN作為免疫佐劑起到誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌和病毒的感染的作用(Krieg, 2002)。

魚類同時(shí)具有Tlr9和Tlr21兩種CpG DNA受體。CpG-ODN的作用在魚類中與在哺乳動(dòng)物中相似, 能夠活化巨噬細(xì)胞, 誘導(dǎo)白細(xì)胞增殖(Tassakka et al, 2003; Carrington et al, 2004; Chaung, 2006), 刺激細(xì)胞因子的表達(dá)(J?rgensen et al, 2003)。例如用含有特征基序GTCGTT的CpG-ODN 2395 (5′- TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3′)對(duì)大菱鲆進(jìn)行進(jìn)行體內(nèi)感染后, 發(fā)現(xiàn)大菱鲆鰓、頭腎、體腎和肌肉中的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(Li et al, 2017)。用含有5′-AACGTT-3′特征基序的CpG-ODN刺激鯉魚L.的離體培養(yǎng)頭腎細(xì)胞, 能夠激活頭腎巨噬細(xì)胞的活性, 引起白細(xì)胞增殖(Tassakka et al, 2003)。多種CpG-ODN的刺激都可以引起虹鱒魚離體培養(yǎng)脾細(xì)胞和頭腎細(xì)胞的外周血白細(xì)胞的增殖(Carrington et al, 2004)。CpG-ODNs還能間接刺激大西洋鮭魚白細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子(J?rgensen et al, 2003)。斑馬魚優(yōu)先識(shí)別含有GTCGTT特征基序的CpG-ODN (CpG-2006和CpG-2007), 激活下游免疫通路, 進(jìn)而引起IFN-γ、TNFb和IL-1的產(chǎn)生, 而以GACGTT為特征基序的CpG-2000和以AACGTT為特征基序的CpG-HC4040的刺激沒有引起明顯的免疫反應(yīng)(Yeh et al, 2013)。

注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 線紋海馬腎臟的在注射CpG-2007和CpG-HC4040后表達(dá)量明顯增加(＜0.05), 注射CpG-2000和CpG-2006的海馬腎臟中表達(dá)量出現(xiàn)下降(＞0.05), 說明線紋海馬的Tlr21對(duì)以AACGTT為特征基序的CpG-HC4040和特征基序?yàn)镚TCCGTT的CpG-2007有識(shí)別功能, 而對(duì)以GACGTT為特征基序的CpG-2000識(shí)別能力不強(qiáng)。根據(jù)對(duì)免疫應(yīng)答的不同影響, 研究者把CpG-ODN分為三大類型: CpG-A, CpG-B和CpG-C(Cooper et al, 2008)。A型CpG-ODN以含有CpG二核苷酸的回文序列為核心, 兩端為poly G尾, 磷酸二酯鍵骨架為部分硫代化修飾, 這類CpG-ODN通過回文序列和poly G形成高級(jí)結(jié)構(gòu), 能夠活化Nκ細(xì)胞和pDC細(xì)胞, 誘生大量IFN-α, 對(duì)B細(xì)胞活化能力有限(Krug et al, 2001; Gürsel et al, 2002; Vollmer et al, 2004)。B型CpG-ODN是全硫代化修飾的線性CpG-ODN, 不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu), 對(duì)B細(xì)胞有很強(qiáng)的刺激活性(Bernasconi et al, 2003), 對(duì)Nκ細(xì)胞活化能力較弱, 活化pDC細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和IFN-α的能力也有限(Ballas et al, 1996)。C型CpG-ODN為全硫代化修飾, 能夠通過回文序列形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和二聚體, 它們兼具A型和B型CpG-ODN的活性, 能夠激活B細(xì)胞和Nκ細(xì)胞, 產(chǎn)生DC IFN-α分泌物(Hartmann et al, 2003; Marshall et al, 2003; Vollmer et al, 2004)。A型和C型CpG-ODN的高級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響Tlr9的細(xì)胞內(nèi)定位和交叉連接。B型CpG-ODN是使用廣泛的免疫佐劑, CpG-2006、CpG-2007和CpG-HC4040都屬于B型。在一項(xiàng)關(guān)于雞TLR21功能的研究中發(fā)現(xiàn), 屬于C型CpG-ODN的CpG-2429對(duì)于雞TLR21的刺激作用最為明顯, B型CpG-ODN CpG-2007的作用次之, 而在小鼠中免疫刺激作用很強(qiáng)的CpG-1826, 對(duì)于雞TRL21的活化能力僅為CpG-2007的一半(Brownlie et al, 2009), 說明CpG-ODN的免疫刺激作用存在物種差異。在我們的實(shí)驗(yàn)中, 同為B型的CpG-2006和CpG-2007的特征基序相同, 均為GTCCGTT, 且在序列中都有3個(gè)重復(fù), 但是它們對(duì)線紋海馬Tlr21的刺激作用明顯不同。出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是TLR21對(duì)不同類別CpG-ODN的識(shí)別存在物種的差異性。

綜上所述, 本研究探討了線紋海馬基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式, 線紋海馬與其他魚類的序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都具有較高的相似性,在線紋海馬各組織廣泛表達(dá), 主要在海馬腎臟中高表達(dá); CpG-ODN感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, CpG-2007和CpG-HC4040兩個(gè)序列能夠刺激線紋海馬在腎臟中的表達(dá), 說明Tlr21在線紋海馬能夠通過識(shí)別含CpG序列的DNA發(fā)揮免疫識(shí)別作用。

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The gene structure ofin lined seahorse,, and its responses to CpG-ODN treatment

ZHANG Yuan1, 2, QIN Geng1, ZHANG Bo1, 2, LIN Qiang1, 2

1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Toll-like receptors (TLRs) are the major pattern recognition receptors (PRR) of the innate immune system in vertebrates, which can initiate host immune responses by recognizing potential pathogens. The present study focused on the role of Tlr21 involved in immune responses in lined seahorse (). The full-length sequence of the lined seahorsegene was cloned. The openreading frame (ORF) of seahorsegene includes 2964base pairs, which is predicted to encode 981 amino acids. The encoding protein had a predicted molecular mass of 246.98 kDa and an estimated isoelectric point of 4.78. Homology comparison and phylogenetic analysis showed that lined seahorse1 shared high sequence identity with its homologs from other species, especially those species in Syngnathidae. Quantitative real-time PCR analysis showed that1 mRNA was widely expressed in various tissues and expressed highest in the kidney. We conducted intraperitoneal CpG-ODNs injections to the lined seahorses. Both CpG-2007 and CpG-HC4040 increased expression levels of1 mRNA in seahorse kidney significantly. In conclusion, these findings indicated thatinitiated the innate immunity in lined seahorse by recognizing CpG DNA.

; gene structure; CpG-ODN; immunity; Lined seahorse; tissue expression difference

2018-04-01;

2017-05-25. Editor: SUN Shujie

National Natural Science Foundation of China (41706178); Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (2017A030313214)

P735

1009-5470(2019)01-0067-09

10.11978/2018034