徐引弟 ，張青嫻 ，王治方 ，焦文強 ，李海利 ，朱文豪 ，王克領

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州450002）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又稱豬地方流行性肺炎（swine enzootic pneumonia），俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）引起的豬的一種慢性呼吸道傳染病，其是豬呼吸系統(tǒng)的主要病原，在豬呼吸系統(tǒng)綜合征（PRDC）中起著重要作用。MPS發(fā)病的第一階段是豬肺炎支原體通過黏附素p97，p102和p159與呼吸道黏膜纖毛上皮細胞黏附，此外，豬肺炎支原體還能產(chǎn)生過氧化氫，從而導致相應部位的炎癥病變，造成纖毛的停滯、聚集和脫落以及對呼吸道上皮的直接毒性傷害，最終導致細菌的清除減少，并為繼發(fā)性呼吸道感染打開大門。預防和控制豬肺炎支原體一般采用優(yōu)化管理方法，如全進全出、多點操作、抗菌藥物和疫苗。豬肺炎支原體的無菌狀態(tài)很難維持，特別是在豬密度較高的地區(qū)，因為病菌在空氣中傳播可能長達幾千米。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類藥物最常用于控制和治療豬肺炎支原體引起的呼吸道疾病，然而，抗生素不能從呼吸道清除豬肺炎支原體，也不能恢復已經(jīng)發(fā)展的肺部病變；此外，抗生素的大量使用和不合理的使用還會導致抗生素的耐藥性增加，這對動物和人類健康都有重要的不利影響。商業(yè)化疫苗被廣泛應用于防治豬支原體肺炎，接種疫苗可以減少臨床癥狀和肺部病變的發(fā)生，但另一方面并不能阻止支原體對呼吸道上皮的定植[1-3]。

本研究從河南省發(fā)生呼吸道疾病的豬場的豬肺中分離鑒定豬肺炎支原體，旨在為河南省豬肺炎支原體的感染情況、流行病學及綜合防制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料與參考毒株 病料來自于2017年1—12月在河南省大中型豬場發(fā)生重癥肺炎呼吸困難的豬的實變的肺臟；陽性對照為豬肺炎支原體168疫苗株，購自南京天邦生物公司。

1.1.2 主要試劑和酶 PPLO肉湯粉、腦心浸出粉、酵母粉購自Difco公司；葡萄糖購自上海國藥集團公司；MEM、豬血清購自Hyclone公司；L-精氨酸、酚紅購自Solarbio公司；青霉素，瓊脂粉，2×PCR Mix，DL2000 Marker，Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1.2.1.1 PPLO液體培養(yǎng)基 PPLO肉湯粉21 g，腦心浸出粉16 g，葡萄糖50 g，酵母粉5 g，溶于800 mL超純水中，調(diào)pH值為7.6，定容至1 000 mL，115℃滅菌15 min，配成基礎液；再加入MEM培養(yǎng)基5 mL、豬血清50 mL、青霉素8萬單位、10%精氨酸10 mL和1%（m/V）酚紅500 μL。培養(yǎng)基于115℃滅菌15 min后，于4℃保存?zhèn)溆?。其中，青霉素、精氨酸、酚紅配制為高濃度溶液后過濾除菌，后于-20℃保存。

1.2.1.2 PPLO固體培養(yǎng)基 其是在PPLO液體培養(yǎng)基中加入1.5%（m/V）瓊脂粉。培養(yǎng)基于115℃滅菌15 min后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豬肺炎支原體的分離培養(yǎng) 取適量肉變的病變肺組織加入2 mL的滅菌PBS緩沖液，研磨，取上清，5 000 r/min離心10 min，取上清液0.45 μm濾膜過濾于PPLO液體培養(yǎng)基中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5～7 d后，取1 mL轉接PPLO液體培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，傳代3～5代后液體顏色由紅色變?yōu)辄S色，取100 μL涂布PPLO固體培養(yǎng)基表面，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～10 d后，在低倍顯微鏡下逐日觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)。吉姆薩染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 豬肺炎支原體的PCR鑒定

1.2.3.1 引物的設計 根據(jù)GenBank中豬肺炎支原體J株（GenBank No.AE017243），7488 株（Genb-ank No.AE017244），232 株 （GenBank No.AE017332），7422株（GenBank No.CP003802）16S rRNA基因序列設計1對通用引物，用于豬肺炎支原體的擴增，由上海生物工程有限公司合成，引物序列為：上游引物 P1：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTG-3′；下游引物 P2：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTAC GA-3′，預計擴增目的片段1 600 bp。

1.2.3.2 豬肺炎支原體的DNA提取 用PBS液將PPLO固體培養(yǎng)基上的菌落洗下，離心、收集菌體，按照DNA提取試劑盒操作說明提取DNA。

1.2.3.3 PCR檢測 PCR體系為 25 μL：2× PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，純水 ddH2O 8.5 μL；待測 DNA2 μL。

PCR 擴增程序為：95℃ 4 min；95℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；最后72℃5 min。取10 μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.4 PCR產(chǎn)物的回收與純化 將陽性PCR產(chǎn)物回收，16℃連接PMD19-T載體過夜，轉化JM109感受態(tài)細胞，涂布含AMP，x-gal，IPTG的LA平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取白斑于含AMP的LB中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，PCR檢測，陽性質(zhì)粒由生工生物工程（上海）有限公司測序，序列用Blast軟件進行比對分析。

1.2.4 河南省部分豬場豬肺炎支原體的流行情況調(diào)查 2017年1—12月從河南省豬場發(fā)生呼吸困難的豬的實變的肺臟共采集148份，分離鑒定豬肺炎支原體，測序并比對。

2 結果與分析

2.1 豬肺炎支原體的分離培養(yǎng)

肺組織上清傳代后，PPLO固體培養(yǎng)3～5 d后，肉眼可見極小的透明針尖狀菌落；低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)可知，形態(tài)有的為典型的支原體“煎荷包蛋樣”，有的為圓形、隆起的不具備“煎荷包蛋樣”菌落（圖1）。吉姆薩染色，油鏡下觀察支原體菌體形態(tài)可知，其為多形態(tài)，呈球狀、桿狀、螺旋狀、絲狀，大多呈絲狀（圖2）。

2.2 豬肺炎支原體的PCR鑒定

將疑似豬肺炎支原體的肺組織提取DNA，進行擴增，結果擴增出與預期大小符合的片段（圖3）。陽性片段回收，連接T載體，由測序、比對可知，序列與168株同源性均在95%以上。

2.3 河南省部分豬場豬肺炎支原體的流行情況調(diào)查

2017年1—12月從河南省豬場發(fā)生呼吸困難的豬的實變的肺臟共采集148份樣品，共分離鑒定出25株，分離率達16.89%。PCR鑒定后測序，與疫苗株168株同源性均在95%以上，與標準株7422株 （GenBank No.CP003802），J株（GenBank No.AE017243），7488 株（GenBank No.AE017244），232株（GenBank No.AE017332）同源性均在98%以上，結果證實，所分離的均為豬肺炎支原體。表明河南省發(fā)生呼吸道疾病的豬場豬肺炎支原體的陽性率較高。

3 結論與討論

豬肺炎支原體可在豬群中持續(xù)存在，各種年齡、品種、性別的豬都易感染。該病一年四季都可發(fā)生，冬季容易多發(fā)。病豬和隱形帶毒豬是主要傳染源，無臨診癥狀有病理變化豬，或無臨診癥狀無病理變化陰性帶菌豬比較常見。MPS的診斷方法主要有病原的分離和鑒定、ELISA方法檢測抗體、PCR、原位雜交、芯片檢測等[4-13]。其中，PCR方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學診斷中較為普遍的一種方法。而病原的分離鑒定是檢測病原最為準確、最有效的方法。

常規(guī)的病原鑒定通常是先分離培養(yǎng)，然后根據(jù)病原在固體或液體培養(yǎng)基上的生長情況、菌落形態(tài)、生理生化特征，進而挑菌、染色、鏡檢，最后PCR、測序鑒定，該方法操作復雜、所需時間長。而對于豬肺炎支原體，由于常規(guī)的PCR檢測操作中，對病變肺組織進行研磨后，豬肺炎支原體的含量極少，因此，PCR方法容易出現(xiàn)假陰性的結果，豬肺炎支原體生長條件比較嚴苛，通常在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d才可以看到培養(yǎng)液顏色的變化，而且必須通過3～5代甚至6～8代的傳代才能富集豬肺炎支原體，從而分離出病原菌，同時，在豬患支原體肺炎時，會同時感染豬鼻支原體和絮狀支原體，后二者很容易掩蓋前者，不利于豬肺炎支原體的檢出。因此，將豬肺炎支原體進行培養(yǎng)基擴增后與PCR檢測方法相結合，利用豬肺炎支原體的16S rRNA基因序列設計出特異性引物，其對于常見的豬鼻支原體、豬敗血支原體、胸膜肺炎放線桿菌、沙門氏菌等其他常見病原菌則不能擴出特異片段，以此確保檢測的準確性及特異性。因此，PCR方法和分離鑒定方法各有優(yōu)缺點，只有PCR檢測方法和分離鑒定方法相結合，才能準確地檢測出病原[7-10]。

由于豬肺炎支原體的生長條件苛刻，培養(yǎng)基成分十分復雜，配制非常繁瑣，培養(yǎng)時間長，因此，選擇合適的培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)，縮短培養(yǎng)時間，是提高分離效率的關鍵。本試驗選擇了PPLO加酵母粉、腦心浸粉、MEM、葡萄糖、精氨酸、豬血清的培養(yǎng)基，成分相對簡單，配制簡單，但營養(yǎng)高，液體5～7 d能看到顏色明顯變化，固體培養(yǎng)基最早3～5 d就能看見明顯的菌落生長，大大提高了培養(yǎng)效率，縮短了培養(yǎng)時間，提高了分離效率[13-14]。

由于臨床上抗生素的大量使用，使得豬肺炎支原體的耐藥性十分嚴重，從我們采集的病料來看，大多是使用過大量抗生素治療的，部分是使用過疫苗的，但效果仍然不明顯，或者容易反復，臨床癥狀和肺部病變?nèi)匀坏湫停糠秩匀荒芊蛛x出豬肺炎支原體。因此，科學合理使用抗生素和疫苗是防控豬支原體肺炎的關鍵[15]。

本研究結合豬肺炎支原體的PCR方法和分離鑒定方法，通過對河南省豬場的患呼吸道疾病的豬進行豬肺炎支原體的分離鑒定，分離率高達16%以上。表明豬肺炎支原體在患呼吸道疾病的豬群中感染率較高，是危害豬場較為普遍、嚴重的病原。研究結果可為河南省豬肺炎支原體的病原流行病學研究、疫苗的研究及綜合防制提供一定的依據(jù)。