焦文強(qiáng) ，許 峰 ，徐引弟 ，王治方 ，張青嫻 ，王克領(lǐng) ，朱文豪 ，李海利 ，張立憲 ，郎利敏

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州450002）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），核酸類型為單股正鏈RNA。豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由PEDV感染豬引起的一種高度接觸性腸道傳染性疾病，臨床以嘔吐、腹瀉和脫水為主要特征。該病對各種年齡階段的豬均易感，尤其是7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，發(fā)病后死亡率可達(dá)100%。1971年英國首次報道PED的流行[1]，隨后迅速蔓延到歐洲其他國家，并在比利時流行期間被證實其病原為PEDV，給歐洲養(yǎng)豬業(yè)帶來了重大損失[2-3]。在亞洲，日本、韓國、泰國以及越南都曾報道過PED的流行[4-6]。我國于1984年首次報道PEDV在我國豬場的存在，并且在2010年以前主要以零星出現(xiàn)為主[7]，但是從2010年10月開始，我國南方較多省份暴發(fā)了PED，并迅速蔓延到全國多個省份和地區(qū)，測序證明，本次PED暴發(fā)是由變異的PEDV引起。

2017年10月至2018年2月，豫北某免疫過豬流行性腹瀉疫苗的規(guī)模化豬場產(chǎn)房2日齡仔豬突然發(fā)生水樣腹瀉、嘔吐，迅速脫水死亡，且傳播迅速，發(fā)病率為80%，死亡率達(dá)到90%，剖檢病例變化主要表現(xiàn)為腸壁變薄，腸黏膜脫落，胃內(nèi)有大量固體狀奶塊。通過臨床癥狀和病例變化分析，初步懷疑為豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒與細(xì)菌混合感染引起的消化道綜合征。通過臨床診斷和實驗室診斷，最終確定為豬流行性腹瀉病毒感染。

本研究對CH-HeNXX-2017毒株進(jìn)行了全基因組序列測定，旨在分析該毒株與疫苗毒株在基因序列和抗原性等方面的差異，為以后PEDV疫苗毒株的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 無菌采集瀕死的仔豬的腸道組織，加入1 mL滅菌PBS，在研缽中充分研磨后倒入1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，取上清置-80℃冰箱備用。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒、MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、pMD20-T載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞、T4DNA連接酶、DL 2000 Marker、核酸染料、DNA膠回收試劑盒、小型質(zhì)粒提取試劑盒，均購自于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；瓊脂糖購自于Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自于北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清購自于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的檢測 取-80℃凍存的組織上清液，按照RNA提取說明書進(jìn)行RNA抽提。抽提的RNA立即用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系如下：5×MLV緩沖液 2 μL，dNTP 2 μL，MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，RNA酶抑制劑0.3 μL，特異性檢測引物0.3 μL，加入RNA 4.9 μL，共 10 μL，充分混勻后置 42 ℃水浴1 h，然后70℃反應(yīng)10 min后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：cDNA1 μL，上、下游引物各 1 μL，10×Taq Buffer 5 μL，dNTP 8 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μL。引物參照文獻(xiàn)[8]，并進(jìn)行少許優(yōu)化。

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μLPCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，回收與預(yù)期大小相符的片段，連接pMD19-TSimple載體，4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)15 h后挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 豬流行性腹瀉病毒的分離 將生長狀態(tài)良好的Vero細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用無菌的PBS沖洗細(xì)胞2次，然后將病料上清加入到細(xì)胞中，加胰酶至終質(zhì)量濃度5～6 μg/mL，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，每隔15 min晃動一下細(xì)胞，以確保病料上清與細(xì)胞充分結(jié)合[9-10]。2 h后棄去培養(yǎng)液，加入終質(zhì)量濃度為5～6 μg/mL的胰酶，37℃連續(xù)培養(yǎng)96 h，并連續(xù)盲傳5代，待觀察到有細(xì)胞病變時收獲病毒液。

1.2.3 PEDV CH-HeNXX-2017株基因組全長的擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計的引物進(jìn)行全基因組序列的擴(kuò)增。引物序列參照表1。具體的反轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同1.2.1。

表1 PEDV CH-HeNXX-2017株全序列擴(kuò)增引物

續(xù)表1

1.2.4 PEDV CH-HeNXX-2017株遺傳進(jìn)化分析將本研究得到的PEDV CH-HeNXX-2017株全長基因組序列與GenBank中下載的國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比對，應(yīng)用MEGA5.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，采用Neighbor-Joining算法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒（TGE）和豬輪狀病毒（RV）的RT-PCR檢測

按照本研究設(shè)計的引物，可以擴(kuò)增出約500 bp的片段，而豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒則沒有目的條帶出現(xiàn)（圖1）。根據(jù)此結(jié)果判斷，豬流行性腹瀉病毒陽性，豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒陰性。

2.2 豬流行性腹瀉病毒的分離

從圖2可以看出，用病毒上清接種Vero細(xì)胞盲傳5代以后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、腫脹等形態(tài)變化，最后發(fā)現(xiàn)多核體特征性病變（2-A），確定為病毒分離成功。

2.3 PEDV CH-HeNXX-2017株基因組全長的擴(kuò)增

采用本研究中的引物，將PEDV CH-HeNXX-2017分為19段進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過片段之間的重疊部分將整個基因組全長拼接起來（圖3，4）。

2.4 PEDV CH-HeNXX-2017株遺傳進(jìn)化分析

通過進(jìn)化樹分析，本研究得到的CH-HeNXX-2017株（圖5中的三角標(biāo)記）與傳統(tǒng)毒株如CV777，LZC，DR13等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與新近分離的毒株如IA1，USA Colorado 2013，MN和PC22A等在同一個進(jìn)化分枝中，親緣關(guān)系較為接近（圖5）。

3 討論

1984年，我國成功分離出第1株P(guān)EDV毒株，證明了PEDV在我國的存在。但是直到2010年以前，PEDV在我國主要呈現(xiàn)地方零星出現(xiàn)的特點，很少出現(xiàn)大范圍的流行。2010年開始，我國大部分省份都經(jīng)歷了一次PEDV疫情，給養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。

本研究得到的CH-HeNXX-2017全基因組序列，分離自豫北某規(guī)模化豬場，該場一直對母豬進(jìn)行PEDV免疫，且未見大范圍仔豬腹瀉的發(fā)生，但是這次突發(fā)產(chǎn)房仔豬腹瀉，臨床癥狀表現(xiàn)為水樣腹瀉，迅速脫水死亡。經(jīng)過臨床診斷和剖檢病理變化，并結(jié)合實驗室檢測，最終確定為是由PEDV感染所致。說明PEDV病毒可能已經(jīng)發(fā)生了變異，抗原性和免疫原性已經(jīng)發(fā)生較大變化，接種現(xiàn)有的疫苗不能完全中和病毒的繁殖。為了進(jìn)一步分析此次疫情毒株的遺傳進(jìn)化情況，通過全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，本研究得到的CH-HeNXX-2017 與 IA1，USA Colorado 2013，MN 和 PC22A 等毒株在同一個進(jìn)化分析中，親緣關(guān)系較為接近，而與傳統(tǒng)毒株CV777和LZC等毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與趙麗等[13-14]的研究結(jié)果一致。其原因主要是因為RNA病毒在自身基因組復(fù)制過程中缺少5′-3′DNA聚合酶的校正功能，加之PEDV與野毒株之間不斷進(jìn)行重組、突變和缺失，造成了PEDV一直處于不斷進(jìn)化變異中。因此，對病毒進(jìn)行長期的遺傳進(jìn)化分析，對于臨床診斷和疫苗研發(fā)等具有重要意義。另外，PEDV對于腸道組織具有明顯的嗜性，除了常規(guī)的細(xì)胞免疫和體液免疫以外，黏膜免疫也具有重要的抗病毒作用。目前，我國使用的PEDV疫苗多為全病毒滅活苗，且多為肌肉注射，這樣并不能完全激活黏膜免疫在抗PEDV的作用[15]。因此，對于PEDV疫苗的研發(fā)需要考慮多種因素，在PEDV防控和疫苗研發(fā)方面還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。