宋加艷 ，周小露 ，劉麗明 ，趙幸運 ，石 悅 ，周才碧

（1.黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州都勻558000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙410000）

貴州省茶葉種植面積約46.7萬hm2，是全國種植茶葉面積最大的省份，其中，黔南州的種植面積為10.7萬hm2，也是貴州省比較重要的茶區(qū)之一。黔南州在《關(guān)于進一步加快推進茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》中明確提出有機茶今后的發(fā)展目標(biāo)，以及在有機茶園建設(shè)中，必須提高無害化有機肥的投入使用。有機肥是特定的微生物與經(jīng)過腐熟等工藝流程的農(nóng)作物秸稈復(fù)合而形成的微生物有機肥料，其具有無毒性、肥效高、成本低、節(jié)約能源等優(yōu)點。

茶樹生長必需的養(yǎng)分大部分是土壤供給的，但土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)只能通過施肥來補充。長期大量施用化肥，容易導(dǎo)致土壤板結(jié)、酸化、地下水硝酸鹽含量超標(biāo)以及土壤基礎(chǔ)肥力下降等問題。施用化肥也是茶葉有害物質(zhì)超標(biāo)的主要原因之一，特別是含鉛、汞等化肥引起的重金屬超標(biāo)。

相關(guān)研究表明，貴州茶區(qū)存在不同程度的土壤酸化、重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留等問題。如都勻茶區(qū)pH值3.50～4.00，土壤嚴(yán)重酸化[1-2]；湄潭和鳳岡茶區(qū)pH值在4.00～4.50，土壤酸化；正安茶區(qū)pH值在4.00～5.00，土壤有酸化趨勢；云霧區(qū)存在嚴(yán)重的Cd和Hg污染[3]；貴定縣有2個茶園土壤處于輕污染狀態(tài)，8個鄉(xiāng)鎮(zhèn)處于警戒限范圍[3-5]；貴州省約9個市茶區(qū)鉛[6]、氯氰菊酯等重金屬均有不同程度的檢出，但沒有超標(biāo)。

施用化肥是一種給茶樹補充營養(yǎng)物質(zhì)的有效途徑，能為茶樹的生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng)成分，又可在一定程度上改良土壤。土壤是植物吸收養(yǎng)分的主要來源之一，通過給茶樹施肥能改良茶樹因缺少大量元素帶來的葉片發(fā)黃等問題。茶樹專用有機肥，速效與緩效養(yǎng)分協(xié)調(diào)、肥料利用率比較高，可以減輕氮肥造成的硝酸鹽積累以及磷鉀肥造成的污染，其既可作基肥又可作追肥，將成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然選擇。因此，都勻毛尖茶區(qū)專用有機肥菌種資源的開發(fā)與應(yīng)用具有極其重要的意義。

本試驗以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，分離、純化得到優(yōu)勢菌株，并對其進行形態(tài)鑒定和分子鑒定，旨在明確優(yōu)勢菌株的種屬關(guān)系，為其在茶園專用有機肥的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 供試土樣采集于貴州省黔南州都勻市三江堰茶園。

1.1.2 試劑與儀器 蔗糖（化學(xué)純，貴陽中川化工有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，壽光市艾益農(nóng)生物科技有限公司），七水合硫酸鎂（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），氯化鉀（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠），瓊脂粉（北京鼎國昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司），七水合硫酸亞鐵（分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司），硝酸鈉（分析純，貴陽中川化工有限公司）等。

電子顯微鏡（XSP-8C，德卡精密量儀有限公司），電子天平（LTI000B，常熟市天量儀器有限責(zé)任公司），恒溫培養(yǎng)箱（BIC-250，上海博迅實業(yè)有限公司），超凈工作臺（SW-CJ1FDA，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），高壓蒸汽滅菌鍋（GI54DS，致微儀器有限公司），冰箱（BCD-251WBSV，上海帝覽實業(yè)有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 參考周才碧等[7]的方法，按試驗要求進行適當(dāng)修改。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉20 g。WA培養(yǎng)基：瓊脂粉13 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 菌株分離培養(yǎng) 稱取20 g茶園土樣放入三角瓶，加入80 mL無菌水，搖勻制備成菌種懸液，并將其稀釋成不同濃度菌種溶液備用。再用接種環(huán)蘸取不同稀釋濃度的菌種懸浮液1～2滴，采用涂布法接種于PDA培養(yǎng)基上，每個稀釋濃度6個重復(fù)；將PDA培養(yǎng)基放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6～7 d，有菌落形成時，即對菌株進行純化處理。

1.2.3 菌株純化培養(yǎng) 待培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)6 d可以明顯觀察到菌落時，挑選生長旺盛的菌落，用平板劃線法接種到PDA培養(yǎng)基上；并將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待菌落長出較多時，繼續(xù)劃線純化，直到純化出單一菌落。

1.2.4 菌株形態(tài)特征觀察 利用電子顯微鏡對菌種菌落的孢子囊、分生孢子、厚垣孢子及生長速率等形態(tài)特征進行觀察記錄，以對該菌種菌落的類型進行初步判斷。

1.2.5 菌株生長速率測定 在無菌環(huán)境下，把優(yōu)勢菌株打成直徑為5 mm的菌餅，再轉(zhuǎn)移至25℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d，量取菌落直徑并再次記錄其特征。

1.2.6 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.2.6.1 DNA的提取 挑取約1 mg優(yōu)勢種菌絲，研磨，依次加入500μL裂解液、150μLKAC和50μL異丙醇，反復(fù)離心15 min；收取上清液，加等體積70%的乙醇，離心10 min；等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，收集上清液得優(yōu)勢種菌絲DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，紫外分光光度法檢測DNA的濃度，再稀釋至30～50 ng/μL，備用。

1.2.6.2 PCR擴增 用于引物篩選的PCR擴增反應(yīng)的總體積為 25 μL：1 μL DNA 模板，10×Buffer的緩沖液體 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL和 ddH2O 17.4 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)32次；最后72℃延伸5 min；12℃保存?zhèn)溆?。以通用引?ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成）為引陰性對照，進行PCR擴增，4℃冰箱保存PCR擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，將PCR擴增產(chǎn)物送到測序公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所得序列提交到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫，通過 BLAST 程序，將28SrDNA序列與GeneBank中的核酸序列進行對照，并從數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)序列。采用MEGA 6.0軟件進行多序列比對，并利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建進化樹，確定菌株類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌株的分離、純化

以優(yōu)質(zhì)土壤為材料，利用稀釋涂布分離得到5種菌；進一步利用平板劃線純化該菌株，最終得到優(yōu)勢菌株S1（圖1-A），該菌株在25℃的PDA培養(yǎng)基中生長旺盛，生長周期較長。

2.2 目標(biāo)菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的方法，對分離、純化得到的菌株進行觀察。

通過肉眼觀察，菌絲體為白色，在培養(yǎng)基表面葡匐向上生長，是氣生菌絲中的繁殖菌絲。利用電子顯微鏡觀察，優(yōu)勢菌種形態(tài)特征鮮明，容易識別，其菌落較大，菌絲體向上生長出孢子體，孢子體為圓形，褐色。根據(jù)菌株的菌落和孢子形態(tài)等特征，初步推斷該菌屬為棘孢曲霉（圖1）。

2.2.2 分子鑒定 以棘孢曲霉菌株DNA為模板，用通用引物ITS1/ITS4擴增得到1條646 bp的清晰條帶（圖 2）。

將PCR產(chǎn)物測序后提交到GenBank中，經(jīng)BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，病原真菌的rDNA-ITS序列與Phytophthora nicotianae（MG496018.1）的序列相似度高達99%。依據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3），表明該菌應(yīng)歸為Aspergillus aculeayus。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定其為曲霉屬中的棘孢曲霉。

棘孢曲霉（Aspergillus aculeayus）的具體分類地位如下：

3 結(jié)論與討論

土壤是微生物的大本營，天然棲息地[8]。土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)植物多樣性和生產(chǎn)力的重要驅(qū)動者，直接參與了植物獲得養(yǎng)分和土壤養(yǎng)分循環(huán)2個過程[9]。本試驗以黔南州茶園優(yōu)質(zhì)土壤為材料，進行稀釋，并將樣品懸液涂布于培養(yǎng)皿培養(yǎng)得出多種菌種，又對菌種進行分離，再挑取菌種純化得到優(yōu)勢菌株。為了明確優(yōu)勢菌株的種屬關(guān)系，首先對于優(yōu)勢菌株的鑒定主要采用傳統(tǒng)的生物形態(tài)學(xué)鑒定法，利用電子顯微鏡進行觀察[10]，初步確定該優(yōu)勢菌株為曲霉屬；其次，對于優(yōu)勢菌株采用ITS序列（分子）鑒定法，確定其為棘孢曲霉。

棘孢曲霉JMUdb058固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的能力突出，是一種高產(chǎn)柚苷酶[11]、β-葡萄糖苷酶[12]的微生物新資源。從土壤真菌棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）中分離得到2個新化合物和2個已知化合物，活性測試結(jié)果表明，4個化合物均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性[13]。