孫怡琳 亢 洋 鄭龍芳 張琬茹 馬愛(ài)新趙 建 王 曉 趙先恩*

1(曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東省綠色天然產(chǎn)物與醫(yī)藥中間體高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲阜 273165)2(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014)

1 引 言

近年來(lái)，三氯生(TCS)、β-雌二醇(E2)、壬基酚(NP)和4-辛基酚(OP)作為典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)引起了人們的廣泛關(guān)注[1]。目前，在食品、日用品，甚至飲用水中不同程度地發(fā)現(xiàn)了內(nèi)分泌干擾物[2]。流行病學(xué)研究顯示，某些動(dòng)物和人類的生殖發(fā)育系統(tǒng)和行為異常以及腫瘤發(fā)生率上升，與環(huán)境內(nèi)分泌干擾物密切相關(guān)[3]。毒理學(xué)研究表明，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在濃度極低時(shí)就能對(duì)生命體造成嚴(yán)重威脅[4]。因此，檢測(cè)食品、日用品和環(huán)境水樣中極微量?jī)?nèi)分泌干擾物對(duì)質(zhì)量監(jiān)督與控制具有重要意義。

已報(bào)道內(nèi)分泌干擾物分析檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5，6]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[7，8]、固相萃取高效液相色譜法(HPLC)[9]、超分子溶劑萃取高效液相色譜法[10]和免疫法[11]。免疫法在生物基質(zhì)的內(nèi)分泌干擾物檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，但其無(wú)法區(qū)分具有相似結(jié)構(gòu)的內(nèi)分泌干擾物，并且在檢測(cè)過(guò)程中也容易發(fā)生交叉干擾反應(yīng)。GC-MS、HPLC-MS法報(bào)道較多，但樣品制備復(fù)雜，衍生化條件苛刻，儀器價(jià)格較昂貴。在HPLC分析方法中，主要采用紫外檢測(cè)(UV)、熒光檢測(cè)(FLD)或電化學(xué)檢測(cè)(ECD)法，但這3種HPLC直接檢測(cè)方法的靈敏度有限，而且受實(shí)際樣品復(fù)雜基質(zhì)干擾嚴(yán)重，常難以取得令人滿意的結(jié)果。采用柱前衍生技術(shù)是提高檢測(cè)靈敏度行之有效的手段[12,13]。He等[14]將衍生化試劑4′-甲酰氯羅丹明用于食品中生物胺的分析，顯著提高了檢測(cè)靈敏度，降低了基質(zhì)效應(yīng)。磁固相萃取技術(shù)(MDSPE)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型樣品前處理技術(shù)。黃維等[15]將MDSPE引入尿樣的預(yù)處理中，結(jié)合 HPLC-FLD，對(duì)1-羥基芘進(jìn)行分析測(cè)定。目前，柱前衍生技術(shù)與磁固相萃取技術(shù)相結(jié)合，已開(kāi)始應(yīng)用于HPLC-MS聯(lián)用分析，與傳統(tǒng)方法相比具有顯著優(yōu)勢(shì)[16]。磁性氧化石墨烯對(duì)于羅丹明類化合物具有良好的吸附能力[17]，基于此，本研究采用2′-甲酰氯羅丹明(RHB-Cl)作為柱前衍生化試劑，聯(lián)合磁性氧化石墨烯分散固相萃取技術(shù)，建立了內(nèi)分泌干擾物的高靈敏HPLC-FLD分析方法，實(shí)現(xiàn)了牛奶、牙膏和生活廢水中4種內(nèi)分泌干擾物的快速衍生、富集、凈化。本方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、熒光檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱(美國(guó)Agilent公司); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 超聲波清洗器(浙江昆山超聲儀器有限公司); XW-80A漩渦混勻器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司); SC-06低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司); SHA-C水浴恒溫振蕩器(金壇市金南儀器制造有限公司)。

壬基酚(Nonylphenol，NP，99%)，4-辛基酚(4-octylphenol，OP，99%)，β-雌二醇(β-estradiol，E2，99%)，三氯生(Triclosan，TCS，99%)均購(gòu)自百靈威科技有限公司; 乙腈、甲酸(色譜純，Sigma公司)。其它試劑均為分析純?cè)噭? 衍生化試劑2′-甲酰氯羅丹明(RHB-Cl)為本實(shí)驗(yàn)室合成。

2.2 RHB-Cl的合成

向三口燒瓶中加入1.0 g羅丹明B，足量1,2-二氯乙烷，緩慢滴加2 mL POCl3。反應(yīng)混合物回流4 h，冷卻，旋蒸除去溶劑，得到2′-甲酰氯羅丹明(RHB-Cl)。該產(chǎn)品無(wú)需進(jìn)一步純化，直接配制衍生化試劑用于衍生化反應(yīng)[18]。

2.3 溶液配制

稱取適量TCS、E2、NP和OP標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于乙腈，配制成0.01 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，相應(yīng)低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋而成。取適量4種單標(biāo)溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-4mol/L)。稱取52.4 mg RHB-Cl，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成0.01 mol/L RHB-Cl溶液。

2.4 衍生化方法

安培瓶中加入200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(或?qū)嶋H樣品提取液)、200 μL 衍生試劑(0.01 mol/L)、300 μL Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.5)，封口后渦旋混勻，于室溫(20℃)反應(yīng)5 min，加入50 μL 50%(V/V)冰乙酸溶液調(diào)節(jié)至pH 3～5，該衍生溶液用于下一步富集凈化。衍生化反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 2′-甲酰氯羅丹明與酚類化合物的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatization reaction between 2′-carbonyl chloride rosamine (RHB-Cl) and phenolic endocrine disruptor compounds

2.5 磁固相萃取

向衍生溶液中加入15 mg磁性氧化石墨烯，于25℃水浴恒溫振蕩15 min，磁分離，棄上清液，加入洗脫劑甲醇-乙酸(9∶1，V/V)1 mL，超聲處理5 min，借助磁鐵分離上清液，并轉(zhuǎn)入另一試管，定容至1 mL，過(guò)0.45 μm濾膜后，取20 μL供分析。

2.6 HPLC條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司)。流動(dòng)相：A相為10%(V/V)乙腈溶液(含0.1%(V/V)甲酸)，B相為乙腈(含0.1%(V/V)甲酸)。梯度洗脫程序：0～2 min, 50%～70% B; 2～7 min，70%～85% B; 7～7.5 min，85%～100% B; 7.5～12 min，100% B。流速： 0～7.5 min，1.0 mL/min; 7.5～12 min，1.5 mL/min。進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃。熒光激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和發(fā)射波長(zhǎng)(λem)分別為554 nm和570 nm。

2.7 樣品前處理方法

2.7.1牙膏樣品前處理準(zhǔn)確稱取樣品1.000 g于50 mL尖底離心管中，加入25 mL乙腈-水(9∶1，V/V)作為提取溶劑，超聲波提取20 min，冷卻至室溫，以5000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取10 mL濾液作為試樣溶液，備用。

2.7.2牛奶樣品前處理準(zhǔn)確量取牛奶10 mL于50 mL尖底離心管中，加入20 mL乙腈，旋渦振蕩混勻10 min，靜置30 min以沉淀蛋白質(zhì)，3000 r/min離心30 min，吸出上清液，再加入2 mL乙腈洗滌沉淀，合并上清液，于60℃水浴中氮吹至0.2 mL。

2.7.3生活廢水樣品前處理取5 mL生活廢水于尖底離心試管中，加入1 mL氯仿，室溫下漩渦振蕩萃取3 min，5000 r/min離心6 min，精確吸取下層有機(jī)相，氮吹至干，用1 mL乙腈復(fù)溶后待衍生化。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC條件優(yōu)化

圖2 4種內(nèi)分泌干擾物衍生物的高效液相色譜熒光(HPLC-FLD)色譜圖Fig.2 Chromatogram of the four kinds of endocrine disruptor derivatives with RHB-Cl by high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD)E2：β-雌二醇; TCS：三氯生; OP：4-辛基酚; NP：壬基酚。E2: β-estradiol; TCS: triclosan; OP: 4-octylphenol; NP: nonylphenol.

通過(guò)對(duì)比不同色譜柱(Hypersil BDS、ODS以及Agilent Zorbas不同品牌和規(guī)格的色譜柱)、調(diào)整梯度洗脫程序及流動(dòng)相pH值，最終確定了如2.6節(jié)所述的分離條件，4種內(nèi)分泌干擾物衍生物在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，HPLC-FLD檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖2。由于羅丹明B分子底環(huán)上2′位的羧基易與氧雜蒽環(huán)上相連接的碳發(fā)生環(huán)化，整個(gè)分子異構(gòu)化為不帶正電荷的結(jié)構(gòu)，需添加0.1%甲酸于流動(dòng)相中，才能得到良好的峰形。采用Agilent 1260 HPLC-FLD儀器的在線熒光光譜掃描功能，結(jié)合熒光分光光度計(jì)掃描，確定4種衍生物HPLC檢測(cè)的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為554和570 nm。

3.2 衍生條件的優(yōu)化

RHB-Cl是典型的碳酰氯類衍生試劑，在適當(dāng)?shù)膲A性水-乙腈溶液中，對(duì)酚羥基的衍生速率較快。首先考察了pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響，對(duì)比pH 9.0～10.5 Na2CO3-NaHCO3緩沖液條件下衍生化效果，結(jié)果表明，pH為9.0～9.5時(shí)，4種衍生物的峰面積隨pH值增大而顯著增大; 當(dāng)pH>9.5時(shí)，其峰面積隨pH值增大而顯著降低，在pH=9.5時(shí)達(dá)最大值(圖3A)。當(dāng)pH值繼續(xù)增加，強(qiáng)堿導(dǎo)致衍生試劑和衍生物的分解。因此最終選用pH 9.5的Na2CO3-NaHCO3緩沖液進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

考察了4種衍生產(chǎn)物的峰面積隨衍生試劑用量、衍生時(shí)間、溫度的變化規(guī)律。對(duì)衍生試劑用量考察結(jié)果表明，隨衍生試劑用量的增多，衍生物的峰面積逐漸增大，當(dāng)衍生試劑用量為4種衍生物總量的100倍時(shí)，衍生物的峰面積最大，進(jìn)一步增加衍生試劑用量未見(jiàn)峰面積繼續(xù)增大(圖3B)。對(duì)衍生時(shí)間、溫度考察結(jié)果表明，隨衍生時(shí)間延長(zhǎng)，衍生物的峰面積明顯增大，衍生5 min時(shí)峰面積最大; 隨衍生溫度升高，在15～50℃范圍內(nèi)，衍生物的峰面積變化不顯著，當(dāng)溫度超過(guò)50℃，衍生物的峰面積會(huì)降低(圖3C和圖3D)。這可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高導(dǎo)致衍生物分解。因此，選擇衍生反應(yīng)5 min、室溫(20℃)作為最佳條件。

圖3 內(nèi)分泌干擾物衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化：(A)pH值; (B)衍生試劑用量; (C)反應(yīng)時(shí)間; (D)反應(yīng)溫度Fig.3 Optimization of derivatization reaction conditions: (A) pH value; (B) molar ratio of derivatization reagent for four derivatives; (C) reaction time; (D) reaction temperature

3.3 MDSPE條件優(yōu)化

考察了磁性氧化石墨烯用量、萃取時(shí)間、解吸劑種類和解吸時(shí)間的變化對(duì)萃取效果的影響，萃取后均將溶液定容至1 mL。對(duì)磁性氧化石墨烯用量考察結(jié)果表明，磁性氧化石墨烯用量從5 mg增至15 mg時(shí)，萃取效率明顯增加; 繼續(xù)增加其用量，萃取效率無(wú)明顯增加(圖4A)。萃取時(shí)間從5 min增至15 min時(shí)，萃取效率明顯增加，繼續(xù)增加萃取時(shí)間，萃取效率無(wú)明顯增加(圖4B)。對(duì)甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙酸(9∶1，V/V)、乙醇-乙酸(9∶1，V/V)分別為解吸劑時(shí)的萃取效果考察結(jié)果表明，當(dāng)使用甲醇-乙酸(9∶1，V/V)為解吸劑時(shí)萃取效率達(dá)最大值。解吸時(shí)間從1 min增至3 min時(shí)，萃取效率明顯增加，繼續(xù)增加解吸時(shí)間，萃取效率無(wú)明顯增加。最終選用磁性氧化石墨烯用量15 mg、萃取時(shí)間15 min、甲醇-乙酸(9∶1，V/V)為解吸劑、解吸時(shí)間3 min為最佳條件。

圖4 磁固相萃取條件優(yōu)化：(A)磁性氧化石墨烯(MGO)用量; (B)萃取時(shí)間Fig.4 Effects of magnetic dispersive solid phase extraction (MDSPE) conditions: (A) amount of magnetic graphene oxide (MGO); (B) extraction time

3.4 方法分析性能

3.4.1線性回歸方程、檢出限、定量限與精密度在空白牛奶基質(zhì)乙腈溶液中添加標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照衍生化和MDSPE方法進(jìn)行處理，依據(jù)峰面積Y和實(shí)際進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸，所得各衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)見(jiàn)表1，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.981,檢出限為1.1～1.9 ng/L，定量限為4.0～7.5 ng/L。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，制備混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生液，平行分析6次，保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表1。結(jié)果表明，本方法的精密度良好。

3.4.2與文獻(xiàn)方法的比較本方法與文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)方法在檢出限、樣品體積、分離時(shí)間、檢測(cè)方法、 衍生化(或直接檢測(cè))等方面的對(duì)比見(jiàn)表2。本方法的檢出限僅為不經(jīng)衍生化的直接HPLC-UV的檢出限的幾十分之一[19]、經(jīng)SPE前處理的HPLC-UV或HPLC-FLD檢出限的幾十分之一或幾分之一，而且本方法所需樣品量小，故本方法在檢出限和取樣量方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[20，6]。與經(jīng)衍生化SPE的GC-MS方法相比，檢出限相當(dāng)，但本法所需衍生溫度更低、衍生時(shí)間更短，具有一定優(yōu)勢(shì)[7]。這一方面得益于本方法所采用的衍生化試劑結(jié)構(gòu)，RHB-Cl具有龐大的分子共軛體系，具有顯著的熒光增敏效果。另一方面，本方法采用MDSPE技術(shù)，達(dá)到了富集凈化樣品的目的。另外，RHB-Cl衍生化方法條件溫和、快速，與MDSPE技術(shù)結(jié)合，能夠帶來(lái)樣品前處理的優(yōu)勢(shì)。HPLC分離時(shí)間短，HPLC儀器與熒光檢測(cè)器在普通實(shí)驗(yàn)室較為常見(jiàn)，因此本方法具有一定的普適性。

表1 4種衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限與精密度(n=6)

Table 1 Linear regression equations, correlation coefficients(R), limits sof detection (LODs), limits of quantification (LOQs) and precision of the four derivatives (n=6)

苯酚衍生物Phenolderivative線性回歸方程Linear regressionequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R)檢出限LOD(ng/L)定量限LOQ(ng/L)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD (%, n=6)保留時(shí)間Retention time(min)峰面積Peak areaE2y=24.27x+0.00970.9881.97.52.300.89TCSy=77.88x-0.00060.9811.14.00.671.63OPY=39.62x-0.00420.9961.87.01.530.61NPy=37.32x-0.00280.9991.87.02.360.41y: Peak area; x: Injection amount, pmol.

表2 本方法與文獻(xiàn)方法的比較

Table 2 Comparison of this method with the reported methods

方法Method衍生試劑Derivatizationreagent溫度Temperature(℃)時(shí)間Time(min)檢測(cè)波長(zhǎng)Detectionwavelength(nm)分離時(shí)間Separationtime(min)樣品體積Samplevolume(mL)檢出限 LODs(ng/L)E2TCSOPNP參考文獻(xiàn)RefsHPLC-UV---UVλex=28015-50---[19]SPE-HPLC-UV---UVλex=28043040---[20]SPE-HPLC-FLD---λex/λem=275/30085500--2.04.0[6]SPE-GC-MSMSTFA7590-355002.1-1.22.4[7]MDSPE-HPLC-FLDRHB-Cl205λex/λem=554/570115.01.91.11.81.8ThismethodMSTFA: N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide; -: Not reported.

圖5 生活廢水中4種內(nèi)分泌干擾物衍生物的色譜圖Fig.5 Chromatogram of 4 kinds of endocrine disruptor derivatives in waste water sample

3.5 回收率與實(shí)際樣品分析

按照2.7節(jié)所述的實(shí)際樣品前處理方法，采用最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)3種實(shí)際樣品中4種內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，加標(biāo)回收率在73.9%～118.3%之間，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)要求。同時(shí)，測(cè)定曲阜本地市售牛奶(某品牌盒裝牛奶)、牙膏及生活廢水(取自本地某垃圾站)中4種內(nèi)分泌干擾物含量，結(jié)果見(jiàn)表3，牛奶、牙膏中含有較少的內(nèi)分泌干擾物，生活廢水中含有較多的內(nèi)分泌干擾物，需加強(qiáng)生活垃圾的處理與監(jiān)管，可適當(dāng)采用光催化技術(shù)等[21]，以減少對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的危害。其中生活廢水樣品色譜圖見(jiàn)圖5。

4 結(jié) 論

利用高靈敏熒光衍生化與MDSPE技術(shù)相結(jié)合的策略，建立了4種內(nèi)分泌干擾物的HPLC-FLD分析方法。本方法具有簡(jiǎn)便、快速和靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，且具有良好的適用性。對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，牛奶、牙膏中含有較少的內(nèi)分泌干擾物，而生活廢水中含有相對(duì)較多的內(nèi)分泌干擾物。

表3 3種實(shí)際樣品中內(nèi)分泌干擾物的含量及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

Table 3 Contents and recoveries of endocrine disruptor compounds in three real samples (n=3)

分析物Analytes牙膏 Toothpaste含量Content(ng/L)加標(biāo)量Added(ng/L)回收率Recovery(%)牛奶 Milk含量Content(ng/L)加標(biāo)量Added(ng/L)回收率Recovery(%)生活廢水 Waste water含量Content(ng/L)加標(biāo)量Added(ng/L)回收率Recovery(%)E2NDTCS2.66OPNDNPND10.00118.380.00116.9800.00118.25.0092.240.0090.040093.410.0092.080.0092.480093.310.0081.580.0080.280083.14.09NDNDND10.00101.680.00102.6800103.85.0073.940.0074.640076.310.0096.280.0095.280098.010.00104.280.00102.9800103.85.992.794.756.3710.00111.580.00109.7800113.15.0079.840.0078.940081.210.00104.480.00105.4800106.610.00113.480.00112.5800114.8