崔利利 魏忠林 費 強* 李 明

1(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春 130012) 2(中國計量科學(xué)研究院化學(xué)計量與分析科學(xué)研究所，北京10029)

1 引 言

電化學(xué)通過測量電流和電壓的變化研究電極表面和電解質(zhì)溶液的濃度及電化學(xué)反應(yīng)，因其具有靈敏、快速、價廉等優(yōu)勢而被廣泛使用[1]。然而，僅依靠電信號不能直觀地識別出復(fù)雜氧化還原反應(yīng)的中間體和產(chǎn)物，因此對于電化學(xué)反應(yīng)機理的研究仍存在一定的挑戰(zhàn)。質(zhì)譜是一種通過對質(zhì)荷比(m/z)測量直接獲得待測物分子量的分析技術(shù)[2]，可以快速鑒定電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的中間體和產(chǎn)物，并由此推斷出電化學(xué)反應(yīng)機理。因此，電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用成為解決電化學(xué)現(xiàn)有問題的有力工具[3]。此外，電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其快速、高效等優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)組學(xué)[4]、藥物代謝[5]等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。接口技術(shù)是電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的關(guān)鍵。1971年，Bruckenstein等[6]首次將電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用，利用特氟隆疏水膜直接與多孔電極相連，揮發(fā)性氣體可透過擴散膜并由電子轟擊離子源(Electron impact ion source, EI)進(jìn)行離子化，從而實現(xiàn)質(zhì)譜檢測。Hambitzer等[7]利用熱噴霧作為接口，開發(fā)了電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，并研究了N,N-二甲基苯胺的電化學(xué)氧化過程。1995年，電噴霧(Electrospray ionization, ESI)技術(shù)首次被用于電化學(xué)與質(zhì)譜的聯(lián)用接口[8]。目前，ESI是電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的主要接口。然而，被施加高電壓的電噴霧針和接地的質(zhì)譜儀入口構(gòu)成了一個回路，使ESI源本身成為一個電化學(xué)池，能夠誘導(dǎo)發(fā)生氧化或還原副反應(yīng)[9]。為避免ESI中副反應(yīng)的發(fā)生，需要實現(xiàn)EC與ESI的分離。

可與質(zhì)譜聯(lián)用的電化學(xué)裝置主要包括多孔電解池、薄層電解池和微流體芯片電解池。Bruins研究組采用多孔電解池的EC-MS系統(tǒng)成功模擬了藥物代謝的過程[10]，并實現(xiàn)了電化學(xué)代替化學(xué)試劑或酶試劑對蛋白質(zhì)或多肽的裂解[11]。雖然多孔電解池的電極氧化還原效率高，但電極不易清洗。薄層電解池的電極可以通過拋光清洗保持電極表面活性，但薄層電極的氧化還原效率比多孔電極低，所以為了提高其電化學(xué)轉(zhuǎn)換效率，流速通常小于10 μL/min[12]。由于非揮發(fā)性的無機鹽會抑制質(zhì)譜信號，同時會污染質(zhì)譜接口和離子透鏡，所以在EC-MS中，通常使用甲酸銨或乙酸銨作為電解質(zhì)[7]。在EC-MS系統(tǒng)中，可以根據(jù)實驗需要選擇電極材料，常用的電極材料包括玻碳電極[13]、鉑電極、汞電極[14]、摻硼的金剛石電極[15]和鈦電極[16]等，但很少有研究者使用玻碳電極進(jìn)行電化學(xué)還原反應(yīng)。本研究選擇薄層電解池作為電化學(xué)反應(yīng)池，玻碳電極作為工作電極，0.1% (V/V)甲酸作為支持電解質(zhì)，流速設(shè)定為4 μL/min。

在以電噴霧離子源作為電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用的接口技術(shù)時，如在電化學(xué)池與質(zhì)譜儀之間不采取任何措施，直接施加在噴霧針上的高電壓會對電化學(xué)恒電位儀電路系統(tǒng)造成損壞。為解決此問題，Kraj等在2013年提出的一種新型快速還原二硫鍵的電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用的系統(tǒng)中，特別強調(diào)電化學(xué)池與質(zhì)譜儀之間接地線的去耦合作用[16]。在此之前，Berkel等已經(jīng)提出在電化學(xué)池的出口與質(zhì)譜儀之間使用約30 cm的管路線[17]，或在電噴霧質(zhì)譜系統(tǒng)之前插入一個接地線[18]，或讓整個EC/ESI-MS系統(tǒng)浮在由ESI高電壓誘導(dǎo)的電壓之中[19]，以避免直接施加在噴霧針上的高電壓對電化學(xué)恒電位儀的影響。近年來，常壓質(zhì)譜技術(shù)[20,21]的出現(xiàn)，也為解決這一問題提供了新思路。例如，解吸電噴霧(Desorption electrospray ionization, DESI)以高的耐鹽性、結(jié)構(gòu)簡單等優(yōu)勢成功實現(xiàn)了EC-MS的連接，并且電化學(xué)池與質(zhì)譜儀不直接相連，因此不需要去耦合裝置[22]。另外，Bruins在其綜述[23]中也指出，接地的ESI噴霧針可完全消除上游電流的影響。

本研究提出了一種新型電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，采用噴霧針接地設(shè)計的電噴霧離子源作為接口技術(shù)，避免了直接施加在噴霧針上的高電壓對電化學(xué)恒電位儀的耦合作用，可實現(xiàn)EC和MS的直接在線聯(lián)用，并且簡化了儀器結(jié)構(gòu)。為考察儀器性能，以氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)作為模型樣品，考察了多肽在該系統(tǒng)中的氧化還原行為。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)購自Aladdin公司; 二硫蘇糖醇(DTT，Sigma公司); 甲醇(色譜級，Burdick﹠Jackson公司); 甲酸(色譜級，Roe Scientific公司); 谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)購自于本地藥店; 5 mmol/L醋酸銨緩沖液(pH 5.5)用氨水和醋酸配制并調(diào)節(jié)pH值。

電化學(xué)氧化還原實驗在薄層電化學(xué)電池與Bruker HCT高容量離子阱質(zhì)譜儀(Bruker公司)在線聯(lián)用裝置上完成，如圖1所示。由于電噴霧離子源(Bruker公司)采用質(zhì)譜入口施加反向高電壓的方式對樣品進(jìn)行離子化，因此噴霧針接地，并不施加任何電壓，這種設(shè)計能夠?qū)崿F(xiàn)EC與ESI高電壓的分離，從而避免電噴霧的高電壓對電化學(xué)恒電位儀電路系統(tǒng)的損壞。薄層電化學(xué)池包括嵌入在PEEK內(nèi)直徑為3 mm的雙玻碳工作電極(WE)、Ag/AgCl(3 mol/L NaCl)參比電極(RE)和含有一個小孔的不銹鋼輔助電極(AE)。此電解池由50 μm厚的聚四氟乙烯墊片組成，體積約為7 μL。實驗使用DY2300恒電位儀(日本Digi-Ivy公司)。

圖1 電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)示意圖，包括注射泵、薄層電化學(xué)池和離子阱質(zhì)譜儀Fig.1 Schematic of electrochemistry with mass spectrometry (EC-MS) set up. The device includes a syringe pump, an electrochemical cell and an ion trap mass spectrometer

質(zhì)譜參數(shù)：正離子模式; 毛細(xì)管電壓為4000 V; 霧化氣N2的壓力為310 kPa; 干燥氣N2的流速和溫度分別為4.0 L/min和300℃; 質(zhì)量范圍設(shè)為m/z100～650。二級質(zhì)譜參數(shù)：碰撞氣為氦氣，母離子選擇的窗口寬為m/z1.0，碰撞誘導(dǎo)解離(Collision induced dissociation, CID)能量為0.3～1.2 eV。質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理使用CompassTM軟件(版本4.0)，所列質(zhì)譜圖均為采集0.3 min的平均值。

2.2 實驗方法

2.2.1氧化型谷胱甘肽(GSSG)的還原采用經(jīng)典的DTT化學(xué)試劑還原二硫鍵[24]： 250 μmol/L氧化型谷胱甘肽溶于含有100 mmol/L DTT的5 mmol/L醋酸銨緩沖溶液(pH 5.5)，在37℃下孵育30 min。立即冷卻樣品，抑制進(jìn)一步還原。將溶液用甲醇-超純水(1∶1，V/V)稀釋至50 μmol/L，直接進(jìn)入質(zhì)譜測試。

在線電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)還原二硫鍵：將氧化型谷胱甘肽凍干粉用含有1%(V/V)甲酸-甲醇(1∶1，V/V)稀釋至250 μmol/L，用氮氣除氧20 min。玻碳電極先在拋光布上用3、1和0.5 μm 的氧化鋁依次拋光，待表面打磨光滑后，在蒸餾水中超聲清洗10 min。樣品溶液由注射泵進(jìn)樣，以4 μL/min 的流速(圖1紅線)流經(jīng)電化學(xué)池進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過不銹鋼電極的小孔流出電化學(xué)池，進(jìn)入電噴霧中進(jìn)行離子化。同時，恒電位儀施加-1.7 V 恒電壓對樣品進(jìn)行還原。

2.2.2還原型谷胱甘肽的氧化在線的電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)氧化GSH與還原GSSG的實驗步驟基本相同，不同之處是, 在氧化過程中，施加2.0 V 恒電壓; 還原過程中，施加-1.7 V的恒電壓。

2.2.3樣品的制備取一片谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)研磨，超聲溶解于10 mL超純水中，離心，取上清液，用1%(V/V)甲酸-甲醇(1∶1，V/V)稀釋5倍，待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 氧化型谷胱甘肽(GSSG)的還原

一個GSSG分子的二硫鍵加氫還原生成兩個GSH分子，兩個GSH分子通過脫氫氧化生成一個GSSG分子，其反應(yīng)機理如式(1)所示。

(1)

為了考察在線電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)還原二硫鍵的儀器性能，首先使用了文獻(xiàn)中最常采用的化學(xué)試劑還原二硫鍵的實驗方法，評估了將肽與過量的DTT在37℃溫育30 min后達(dá)到的二硫鍵降低程度。如圖2A所示，經(jīng)DTT還原后的GSSG，一級質(zhì)譜圖顯示m/z308(GSH)與m/z613(GSSG)的峰，說明在上述條件下，DTT并未將GSSG完全還原。為了驗證這一推測，分別對m/z308與m/z613進(jìn)行二級碎裂，如圖2B和圖2C所示，碎片離子的分析結(jié)果表明，DTT的確將氧化型谷胱甘肽進(jìn)行還原，且通過加氫生成了還原型的谷胱甘肽。

圖2 (A)氧化型谷胱甘肽(GSSG)經(jīng)DTT還原后的一級質(zhì)譜圖; (B)經(jīng)DTT還原后的氧化型谷胱甘肽(GSSG)m/z 308的MS/MS圖; (C)經(jīng)DTT還原后的氧化型谷胱甘肽(GSSG)m/z 613的MS/MS圖Fig.2 (A) Mass spectrum of GSSG after dithiothreitol(DTT) reduction; (B) MS/MS spectrum of GSSG after DTT reduction at m/z 308 ; (C) MS/MS spectrum of GSSG after DTT reduction at m/z 613

對在線電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)還原二硫鍵進(jìn)行考察。電化學(xué)池未施加電壓時，GSSG樣品的質(zhì)譜圖見圖3，m/z307.1和m/z613.1分別為[GSSG+2H]2+和[GSSG+H]+。當(dāng)對EC施加-1.7 V 電壓后，[GSSG+2H]2+峰強度下降了83.3%，[GSSG+H]+峰強度下降了88.6%; 并且出現(xiàn)了強度較高的m/z308.1和m/z615.1峰，分別為[GSH+H]+和[2GSH+H]+。為進(jìn)一步確證GSSG在電化學(xué)池中發(fā)生了還原反應(yīng)，對GSH標(biāo)準(zhǔn)品和GSSG發(fā)生電化學(xué)還原后的反應(yīng)產(chǎn)物m/z308分別進(jìn)行CID碎裂，結(jié)果如圖4所示。圖4A和圖4B的二級質(zhì)譜圖都含有[M-H2O]+、b2、y2和y2-NH3離子。由此可知，GSSG中的一對二硫鍵通過獲得2個氫原子被還原為GSH(見式(1))。氧化型谷胱甘肽GSSG是2個GSH通過脫氫氧化形成一對鏈間二硫鍵的多肽。在電化學(xué)中，很難通過循環(huán)伏安法發(fā)現(xiàn)二硫鍵的還原，但通過電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，利用質(zhì)譜進(jìn)行直觀的分子量測定及串聯(lián)技術(shù)，能直接觀察到GSSG與GSH之間的轉(zhuǎn)換。本實驗GSSG的電化學(xué)還原結(jié)果和生成產(chǎn)物GSH的二級碎裂圖結(jié)果與以DESI作為電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用的接口技術(shù)結(jié)果[20]一致。

圖3 氧化型谷胱甘肽(GSSG)在電化學(xué)池(A)未施加電壓和(B)施加-1.7 V電壓后的質(zhì)譜圖。插圖為m/z 307.1的放大圖Fig.3 Mass spectra of GSSG (A) without and (B) with a potential of -1.7 V applied to EC. Insets: the enlarged spectra of m/z 307.1

圖4 (A)還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)品的MS/MS譜圖; (B)氧化型谷胱甘肽(GSSG)在電化學(xué)池施加-1.7 V電壓后的還原產(chǎn)物m/z 308的MS/MS圖Fig.4 (A) MS/MS spectrum of GSH standard; (B) MS/MS spectrum of on-line reduced GSSG with a potential of -1.7 V applied to EC

對比上述兩個實驗可知，在線電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)可實現(xiàn)多肽中二硫鍵的還原，并且在電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用的系統(tǒng)中，無需使用有機還原劑等化學(xué)試劑，無需樣品前處理，允許直接的電化學(xué)還原進(jìn)行質(zhì)譜的分析，簡化了實驗操作，體現(xiàn)了此裝置高效快速等優(yōu)勢。同時，基于質(zhì)譜的碎裂定性功能，可直接對GSSG的還原產(chǎn)物GSH進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

3.2 還原型谷胱甘肽(GSH)的氧化

當(dāng)GSH樣品溶液進(jìn)入電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)時，獲得的質(zhì)譜圖如圖5A所示，m/z308.1和m/z615.1分別為[GSH+H]+和[2GSH+H]+。當(dāng)電化學(xué)池施加2.0 V 的恒電位后，[GSH+H]+峰強度下降了71.7%，同時，出現(xiàn)了m/z613.1 [GSSG+H]+信號(如圖5B)。由此可知，GSH在2.0 V的玻碳電極上發(fā)生了電化學(xué)氧化反應(yīng)，生成了GSSG。對比電化學(xué)池施加電壓前后的結(jié)果可知，施加電壓后確實發(fā)生了電化學(xué)反應(yīng)。如圖5A所示，如若不加電壓，所得結(jié)果與直接質(zhì)譜進(jìn)樣相同。

圖5 還原型谷胱甘肽(GSH)溶液在電化學(xué)池(A)未加電壓(B)施加2.0 V電壓時質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of GSH (A) without and (B) with a potential of 2.0 V applied to EC

為進(jìn)一步驗證GSSG的生成，對電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物m/z613進(jìn)行碎裂，獲得二級質(zhì)譜圖，并將其與GSSG標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖進(jìn)行對比，結(jié)果如圖6所示。GSSH標(biāo)準(zhǔn)品的母離子m/z613.1在CID條件下的MS/MS譜圖見圖6A，m/z595.1為[M+H-H2O]+;m/z484.1為[M+H-E]+，即失去一個谷氨酸殘基的碎片；m/z409.0為[M+H-H2O-E-G]+, 即失去一分子水、一個谷氨酸殘基和一個甘氨酸殘基之后的碎片；m/z355.0為[M+H-2E]+，即失去兩個谷氨酸殘基的碎片。GSH溶液在電化學(xué)池施加2.0 V電壓后，產(chǎn)物m/z613.1在CID條件下的MS/MS質(zhì)譜圖如圖6B。圖6A與圖6B完全一致，表明2個GSH通過電化學(xué)氧化失去2個氫原子形成二硫鍵，反應(yīng)產(chǎn)物為GSSG(式(1)), 同時也表明EC-MS系統(tǒng)能實現(xiàn)GSH中的巰基氧化，并直接對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

圖6 (A)氧化型谷胱甘肽(GSSG)標(biāo)準(zhǔn)品m/z 613的MS/MS圖；(B)還原型谷胱甘肽(GSH)溶液在電化學(xué)池施加2.0 V電壓時氧化產(chǎn)物m/z 613的MS/MS圖。圖中M為GSSGFig.6 (A) MS/MS spectrum of GSSG standard; (B) MS/MS spectrum of GSH with a potential of 2.0 V applied to EC. M represent GSSG

3.3 谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品中GSH的含量測定

為了進(jìn)一步評價此裝置的性能，對谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品中GSH的含量進(jìn)行了半定量分析。首先，利用質(zhì)譜法的二級碎裂對不同GSSG的濃度進(jìn)行測定。在0.04～2.00 μg/mL范圍內(nèi)，GSSG碎片離子m/z484.1的強度(y)與GSSG的質(zhì)量濃度(x)有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=312312x-28735(R2= 0.98)。

基于上述結(jié)果，將0.5 mg/mL GSH以4 μL/min的流速進(jìn)入電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，施加2.0 V電壓，對反應(yīng)生成的m/z613的GSSG進(jìn)行二級碎裂，根據(jù)采集到的碎片離子m/z484.1的強度(26760)，得到生成的GSSG的濃度為0.178 μg/mL。

同時，將稀釋5倍的谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品以同樣的流速進(jìn)入電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，獲得的質(zhì)譜圖如圖7A所示，m/z308.1和m/z615.1分別為[GSH+H]+和[2GSH+H]+。當(dāng)電化學(xué)池施加2.0 V的恒電位后，出現(xiàn)了m/z613.1 [GSSG+H]+信號(圖7B)。同時，對反應(yīng)生成的m/z613的GSSG進(jìn)行二級碎裂，采集到的碎片離子m/z484.1的強度(40931)，根據(jù)上述線性方程，求出對應(yīng)的生成GSSG的濃度為0.2231 μg/mL。通過電化學(xué)氧化效率的轉(zhuǎn)換，得出該稀釋后的樣品中GSH的含量為0.6277 mg/mL，則每片谷胱甘肽片(阿拓莫蘭)藥品中GSH的含量為31.39 mg。

圖7 實際樣品溶液在電化學(xué)池(A)未加電壓(B)施加2.0 V電壓時質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectra of practical sample (A) without and (B) with a potential of 2.0 V applied to EC

4 結(jié) 論

提出了一種新型電化學(xué)與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，采用噴霧針接地的電噴霧離子源作為EC-MS的接口, 選擇氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(GSH)作為典型樣品，考察了聯(lián)用系統(tǒng)的性能。結(jié)果表明，在研究巰基的氧化和二硫鍵的還原時，新構(gòu)建的EC-MS聯(lián)用系統(tǒng)具有明顯優(yōu)勢：(1)在本實驗過程中，無需使用有機還原劑等化學(xué)試劑，無需樣品前處理，簡化了實驗操作；(2)使用噴霧針接地設(shè)計的ESI作為EC-MS聯(lián)用的接口，無需去耦裝置，既簡化了儀器結(jié)構(gòu)，又避免了質(zhì)譜離子源處的高電壓對電化學(xué)恒電位儀的損壞；(3)由于質(zhì)譜定性分析能力強，可通過MS/MS直接對電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行表征。此電化學(xué)-質(zhì)譜系統(tǒng)在電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物和中間體的鑒定、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物代謝等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。