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        獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因克隆及生物信息學(xué)分析

        2019-01-14 07:42:20王園秀張圣潔蔣軍喜
        關(guān)鍵詞:幾丁質(zhì)信號(hào)肽獼猴桃

        賀 哲,王園秀,張圣潔,蔣軍喜*

        (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西南昌330045;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌330045)

        獼猴桃泛指獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)植物,其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特,是我國(guó)近年大力發(fā)展的新興水果之一。江西省奉新縣是我國(guó)獼猴桃主產(chǎn)地之一,其優(yōu)越的自然資源和生態(tài)環(huán)境非常適合獼猴桃種植,但同時(shí)獼猴桃果實(shí)熟腐病(簡(jiǎn)稱(chēng)果腐病)等病害問(wèn)題也十分突出[1-2]。果腐病是一種由子囊菌門(mén)葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的真菌病害,鑒于真菌的細(xì)胞壁主要成分為幾丁質(zhì),發(fā)揮幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)的作用無(wú)疑是防治植物真菌病害的一條有效途徑[1,3-6]。近年來(lái),筆者篩選到對(duì)果腐病具有顯著抗性的‘金艷’等獼猴桃品種[2],并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶基因在接菌的‘金艷’果實(shí)中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá),此結(jié)果表明幾丁質(zhì)酶基因很可能在‘金艷’抗果腐病中發(fā)揮了作用。為此,按前期獲得的轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計(jì)引物,從‘金艷’中克隆幾丁質(zhì)酶基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,以期為深入研究其抗病功能和轉(zhuǎn)基因利用提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        江西省奉新縣山口獼猴桃園中處于近成熟期的‘金艷’獼猴桃果實(shí);葡萄座腔菌菌株BDF-6保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室,接種前在PDA平板上活化培養(yǎng)。

        1.2 接種方法

        將培養(yǎng)菌落外圍菌絲體打成直徑5 mm的菌餅,采用刺傷法將菌餅接種到‘金艷’近成熟果實(shí)上,共接種20個(gè)果實(shí)。接種后72 h從病斑病健交界處對(duì)發(fā)病果肉進(jìn)行取樣,樣品快速取下后立即用液氮速凍并速帶回實(shí)驗(yàn)室于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 獼猴桃總RNA的提取

        使用RNA提取試劑盒(上海普洛麥格),按其操作說(shuō)明提取樣品總RNA。

        1.4 幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增

        以提取的RNA為模板,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega)按其說(shuō)明對(duì)獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增的引物按照前期獲得的獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)自行設(shè)計(jì),上游引物AcC-F:5′-ATGAGGGTTTGGCTACTAGC-3′,下游引物AcC-R:5′-CTATGCAAAAGGCCTCTGGT-3′,由上海生工生物工程有限公司合成,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)期795 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL,上下游引物各2 μL,cDNA模板4 μL,2×TaqPCR Master Mix 25 μL,無(wú)核酸酶水17 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃補(bǔ)平10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        1.5 克隆、測(cè)序及序列分析

        回收目的片段,使用pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒(北京全式金)按其說(shuō)明進(jìn)行克隆,將含有目的片段的陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用Lasergene 7.0 軟件進(jìn)行序列拼接,使用NCBI 中BLAST程序?qū)ζ唇雍玫男蛄羞M(jìn)行在線比對(duì)。

        1.6 序列編碼產(chǎn)物生物信息學(xué)分析

        進(jìn)入表1所列網(wǎng)址對(duì)獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 獼猴桃總RNA提取

        對(duì)接種果腐病菌72 h后的金艷獼猴桃果實(shí)進(jìn)行RNA提取,電泳結(jié)果(圖1)顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰,表明提取的總RNA較完整;條帶明亮,表明總RNA濃度較高,符合實(shí)驗(yàn)要求。

        表1 本研究中生物信息學(xué)分析網(wǎng)址匯總

        2.2 幾丁質(zhì)酶基因的RT-PCR擴(kuò)增

        以提取的總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以cDNA為模板,進(jìn)行獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因完整編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增,結(jié)果擴(kuò)增到一條長(zhǎng)度約為795 bp的片段(圖2),片段長(zhǎng)度與預(yù)期相符。

        M:DL 2 000 marker;1:目的條帶M:DL 2 000 Marker;1:Target product圖1 ‘金艷’獼猴桃果實(shí)總RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agrose gel electrophoresis of total RNA in ‘Jin Yan’ kiwifruit

        M:DL 2 000 Marker;CK:陰性對(duì)照;1:目的片段M:DL 2 000 Marker;CK:Negative control;1:Target product圖2 獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of RT-PCR product of chitinase gene of kiwifruit

        2.3 幾丁質(zhì)酶基因克隆、測(cè)序及序列分析

        對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和序列測(cè)定,獲得其核苷酸序列長(zhǎng)度為795 bp(在GenBank中登錄號(hào)MH580296),編碼264個(gè)氨基酸,將克隆的此基因命名為AcCHI1。經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)AcCHI1氨基酸序列與GenBank中的山茶(Camelliasinensis)幾丁質(zhì)酶基因(GenBank登錄號(hào)KR078345.1)氨基酸序列同源性最高,為81%。

        2.4 獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶蛋白生物信息學(xué)分析

        2.4.1 蛋白結(jié)構(gòu)特征分析 根據(jù)NCBI蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),AcCHI1隸屬于Chitinase_glyco_hydro_19 domain-containing protein(圖3),即屬于19家族幾丁質(zhì)酶,而按氨基酸序列特征被描述為Chitinase class I,屬于I 類(lèi)幾丁質(zhì)酶。

        圖3 AcCHI1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Conserved domains forecast for protein of AcCHI1

        2.4.2 蛋白理化性質(zhì)分析 AcCHI1的分子式為C1288H1935N351O371S11,總原子數(shù)3 956,分子質(zhì)量28.6 ku,等電點(diǎn) 8.58。在氨基酸組成上,最多的氨基酸為Gly (G),共32個(gè),占12.1%,最少的氨基酸為His (H)和Met (M),各3個(gè),占1.1%。酸性氨基酸(Asp+Glu) 19個(gè),堿性氨基酸(Arg + Lys ) 23個(gè);脂肪族氨基酸指數(shù)為69.58,不穩(wěn)定指數(shù)為29.48,推測(cè)為穩(wěn)定蛋白。

        圖4 AcCHI1疏水區(qū)/親水區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic regions of AcCHI1

        2.4.3 蛋白親疏水性預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的親水/疏水性特征是蛋白質(zhì)折疊的基礎(chǔ)。利用在線分析軟件ProtScale對(duì)AcCHI1進(jìn)行親水/疏水性分析(圖4),根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定(即得分<-0.5的區(qū)域?yàn)橛H水區(qū),得分>0.5的區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū),得分在+0.5~-0.5的為兩性區(qū)),AcCHI1含有13個(gè)疏水區(qū),21個(gè)親水區(qū),因此可以認(rèn)為該蛋白在總體上為親水性蛋白。

        2.4.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用TMHMM軟件分析預(yù)測(cè)AcCHI1的跨膜結(jié)構(gòu)(圖5),圖中紅線代表跨膜,紫線代表膜外,藍(lán)線代表膜內(nèi),根據(jù)最上端紫色粗線條顯示,全部氨基酸位于膜外,因此,AcCHI1不具有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于膜蛋白。

        圖5 AcCHI1跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Transmembrane structure analysis of AcCHI1

        2.4.5 信號(hào)肽分析 利用軟件SignalP-4.1對(duì)AcCHI1有無(wú)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖6),其中C-Score為剪切位點(diǎn)值;S-Score為信號(hào)肽區(qū)域值;Y-Score為剪切位點(diǎn)校準(zhǔn)值。由圖6可知該蛋白的S值區(qū)間為1~19個(gè)氨基酸之間,C值最大值在第20個(gè)氨基酸,Y值最大值在第20個(gè)氨基酸。因此推斷AcCHI1含有信號(hào)肽,信號(hào)肽區(qū)域?yàn)?~19個(gè)氨基酸,信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第20個(gè)氨基酸。

        2.4.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 圖7為利用GOR4預(yù)測(cè)的AcCHI1的二級(jí)結(jié)構(gòu),其中組成α螺旋(Alpha helix)的氨基酸共48個(gè),占18.18%,包含在無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)中的氨基酸共149個(gè),占56.44%,組成延伸鏈(extended strand)的氨基酸共67個(gè),占25.38%。

        圖6 AcCHI1信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析Fig 6. Prediction and analysis of signal peptide of AcCHI1

        藍(lán)色線:α螺旋;紅色線:延伸鏈;紫色線:無(wú)規(guī)則卷曲Blue line:Alpha helix;Red line:Extended strand;Purple line:Random coil圖7 AcCHI1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary structure prediction of AcCHI1

        圖8 AcCHI1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Tertiary structure prediction of AcCHI1

        2.4.7 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 三級(jí)結(jié)構(gòu)是指經(jīng)過(guò)充分折疊,能發(fā)揮生物活性、可以執(zhí)行特定生物催化功能的完整三維立體結(jié)構(gòu)。在對(duì)AcCHI1進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模時(shí),以I類(lèi)幾丁質(zhì)酶(4tx7.1.A)作為同源目標(biāo)模板,利用Swiss-Model軟件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)AcCHI1與同源模板結(jié)構(gòu)的相似度為69.67%,圖8為利用同源建模生成的AcCHI1的三維立體結(jié)構(gòu)。

        3 討論

        本研究首次從獼猴桃中克隆到幾丁質(zhì)酶基因AcCHI1(GenBank登錄號(hào)MH580296),并利用生物信息學(xué)方法對(duì)AcCHI1蛋白的分子特征進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明AcCHI1屬于19家族成員,同時(shí)屬于I類(lèi)幾丁質(zhì)酶。目前,有關(guān)幾丁質(zhì)酶的分類(lèi)方式主要有2種,一是根據(jù)幾丁質(zhì)酶催化區(qū)氨基酸序列同源性,將幾丁質(zhì)酶分為2個(gè)家族,即18家族和19家族。其中18家族幾丁質(zhì)酶來(lái)源于細(xì)菌、真菌、病毒及一些植物;19家族主要由植物幾丁質(zhì)酶構(gòu)成,同時(shí)在一些放線菌中也有發(fā)現(xiàn)[6-9]。二是根據(jù)氨基酸序列特征,將幾丁質(zhì)酶分成6類(lèi),即ClassⅠ~Ⅵ,其中的Ⅰ類(lèi)幾丁質(zhì)酶因含有結(jié)合幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,增強(qiáng)了酶對(duì)底物的親和力,而具有強(qiáng)烈的抗真菌活性[10-12]??梢钥闯觯疚膶cCHI1基因歸在19族與19族幾丁質(zhì)酶主要來(lái)自植物的結(jié)論是一致的,同時(shí)也表明AcCHI1基因很可能具有寶貴的應(yīng)用價(jià)值。

        植物中并無(wú)幾丁質(zhì),但幾丁質(zhì)酶普遍存在于植物中,顯然幾丁質(zhì)酶很可能參與植物防衛(wèi)反應(yīng)特別是參與植物對(duì)真菌病害的抗性反應(yīng)[13],由此也引發(fā)了大量有關(guān)植物幾丁質(zhì)酶基因克隆、產(chǎn)物特性及應(yīng)用研究。目前,已從水稻、棉花、煙草、甘蔗、梨、菜豆、馬鈴薯、茶樹(shù)、菊花等100余種植物中克隆到幾丁質(zhì)酶基因[14-19],并且在水稻、花生、黃瓜等多種植物中開(kāi)展了轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因研究,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株不同程度增強(qiáng)了對(duì)一些真菌病害的抗病能力[14,20-21]。奉新縣大部分獼猴桃品種不抗果腐病,特別是‘紅陽(yáng)’、‘金果’等優(yōu)良品種果腐病發(fā)生嚴(yán)重[2],獼猴桃?guī)锥≠|(zhì)酶基因的獲得將為從遺傳上改良這些品種以增強(qiáng)其對(duì)果腐病抗性帶來(lái)了希望。

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