楊 鑫，杜全能，齊文武，張 旭，譚玲玲，廉 欣，蘭時(shí)樂*，李 林*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 2.中法合營(yíng)王朝葡萄酒有限公司，天津 300402)

花生(ArachishypogaeaL.)是一年生豆科草本植物，是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)花生年均總產(chǎn)達(dá)1648.34萬噸，種植面積461.11萬公頃，占世界總產(chǎn)的40%左右[2]。由于花生連作現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致花生種植地土壤理化條件惡化[3]、土壤微生物種群失衡[4-5]、化感自毒作用[6]、產(chǎn)量下降[7]等問題，給我國(guó)的花生生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

植物內(nèi)生菌是指定殖在健康植物組織內(nèi)的一類微生物，可與宿主植物形成共生或寄生關(guān)系，且不引起植物侵染性的病害[8]。近年來，內(nèi)生菌對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量的研究工作[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，花生內(nèi)生菌以芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬和黃單孢菌屬為優(yōu)勢(shì)菌[12]；帶有Bt基因的花生內(nèi)生菌可提高花生的株高、分枝數(shù)、主根長(zhǎng)和地上部、地下部鮮質(zhì)量等生物學(xué)指標(biāo)[13]。

本文從花生根莖葉中分離內(nèi)生細(xì)菌，采用沙培法，以地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和苗高、根系活力、葉綠素含量以及保護(hù)酶活力為指標(biāo)，研究其促生長(zhǎng)作用，為花生內(nèi)生菌的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

內(nèi)生菌分離樣品為湘花2008飽果期的健康植株。供試花生品種為湘花2008，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究所提供。斜面及篩選培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)[14]；生理生化測(cè)定培養(yǎng)基[15]。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，酵母提取粉 0.4%，蛋白胨0.6%，KH2PO40.24%，MgSO4·7H2O 0.12%，NaCl 0.3%，CaCO30.3%，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 花生內(nèi)生菌的初篩

參照文獻(xiàn)[16]提供的分離方法進(jìn)行。將花生根莖和果實(shí)利用自來水沖洗后晾干。將根莖剪成2～3 cm長(zhǎng)，果實(shí)去殼，分別用95%乙醇和0.1% HgCl2進(jìn)行表面消毒5 min，用無菌水將根莖和果實(shí)表面連續(xù)沖洗3次后，分別置于滅菌的研缽中，無菌條件下充分磨碎，適當(dāng)稀釋后，取0.1 mL稀釋液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中央，涂布均勻，同時(shí)取最后一次的沖洗液0.1 mL涂布平板以證明表面消毒是否徹底。37 ℃下培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落，劃線純化，編號(hào)，保存。

1.2.2 花生內(nèi)生菌復(fù)篩

(1) 將河沙用自來水洗凈、曬干后置于干熱滅菌箱160 ℃滅菌2 h，冷卻后稱取2.5 kg于140 mm×111.5 mm×95 mm的花盆中備用。

(2) 幼苗培養(yǎng)[17]：將從花生根莖和果實(shí)中分離得到的11株內(nèi)生細(xì)菌分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌水稀釋至含菌數(shù)為106cfu/mL，將花生種子浸泡于稀釋液中10 min，播種于裝有滅菌河沙的花缽中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中，保持河沙濕潤(rùn)，以無菌水浸泡的種子為對(duì)照。每缽播種3粒種子，每菌3次重復(fù)。觀察種子的發(fā)芽和生長(zhǎng)情況。出苗30 d后將花生苗輕輕地拔出，用自來水將根上的沙子洗凈，用吸水紙將植株及根表面的水吸干，稱根莖重并量取株高。以根鮮質(zhì)量，地上部鮮質(zhì)量和根長(zhǎng)等為指標(biāo)，篩選對(duì)花生具有促生作用的菌株。

1.2.3 內(nèi)生菌鑒定

(1) 形態(tài)觀察。① 菌落形態(tài)特征觀察。將花生內(nèi)生菌YX-1接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)特征。② 菌體形態(tài)特征觀察。通過簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色技術(shù)觀察菌體形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)。

(2) 生理生化特征試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[18-19]提供的方法進(jìn)行碳源利用試驗(yàn)、氮源利用試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、纖維素分解試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等。

(3) 16S rDNA序列分析?；蚪M總DNA提?。喊凑誆zup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，作為后續(xù)16S rDNA序列擴(kuò)增反應(yīng)模板。PCR擴(kuò)增：使用細(xì)菌鑒定通用引物27F(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反應(yīng)體系：0.5 μL DNA模板、0.5 μL 上下游引物、1 μL dNTP、2.5 μL 10×PCR buffer(MgCl2)、0.2 μL Taq DNA 聚合酶，ddH2O補(bǔ)齊到25 μL。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，然后94 ℃變性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，完成30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸10 min。

用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒回收。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過http://www.ncbi.nih.nlm.gov網(wǎng)站用BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用MEGA6.06的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)。

1.2.4 內(nèi)生菌促生作用

(1) 內(nèi)生菌菌液制備。將經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化的內(nèi)生菌YX-1接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

(2) 花生種子的發(fā)芽和處理。將花生種子浸泡于28 ℃溫水中并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽至芽長(zhǎng)2～3 cm，種植于裝有滅菌河沙的花缽中，每缽3粒種子。將用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)至活菌數(shù)為109cfu/mL的YX-1菌株培養(yǎng)液分別用無菌水稀釋10、100、1000和10000倍。試驗(yàn)組分為：CK：澆施等量無菌水；Ⅰ組：澆施10倍培養(yǎng)液稀釋液；Ⅱ組：澆施100倍培養(yǎng)液稀釋液；Ⅲ組：澆施1000倍培養(yǎng)液稀釋液；Ⅳ組：澆施10000倍培養(yǎng)液稀釋液。每次澆量為30 mL。隨機(jī)擺放于光照培養(yǎng)箱中，保持25 ℃、濕度80%～90%培養(yǎng)30 d，光照時(shí)間12 h/d。每處理重復(fù)3次。期間每7 d澆施1次菌稀釋液，并保持河沙濕潤(rùn)。

(3) 測(cè)定項(xiàng)目。① 花生幼苗指標(biāo)測(cè)定：出苗30 d后將花生苗輕輕拔出，用自來水將根上的沙子洗凈，用吸水紙將植株及根表面的水吸干，測(cè)量地上、地下部鮮質(zhì)量以及株高、主根長(zhǎng)。② 葉綠素含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)[20]提供的方法進(jìn)行。③ 根系活力測(cè)定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測(cè)定[21]。④ 花生植株體內(nèi)保護(hù)酶測(cè)定：參照文獻(xiàn)[22]提供的方法進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生內(nèi)生菌初篩結(jié)果

從花生植株及果實(shí)共分離得到11株花生內(nèi)生細(xì)菌，其中根中分離到4株，分別編號(hào)為YX-1～4；莖中分離到3株，分別編號(hào)為YX-5～7；從果實(shí)中分離到4株，分別編號(hào)為YX-8～11。結(jié)果見表1。

2.2 內(nèi)生菌復(fù)篩結(jié)果

表2可看出，內(nèi)生菌株YX-1的平均株高、地上部鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量均最大，分別為19.52cm、3.87 g和1.44 g，但根長(zhǎng)較菌株YX-9小。綜合考慮，選擇內(nèi)生菌YX-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 內(nèi)生菌YX-1鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察

菌株菌落為米黃色，圓形，凸起，邊緣整齊，菌落表面濕潤(rùn)，革蘭氏染色陽性，細(xì)胞桿狀，芽孢橢圓形，偏端生。

表1 初篩結(jié)果

表2 內(nèi)生菌對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

表3 生理生化特征結(jié)果

注："+"表示試驗(yàn)結(jié)果為陽性，"-"表示試驗(yàn)結(jié)果為陰性，"Θ"表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

Note: + indicate positive result, - indicate negative result, Θ indicate acid production without gas.

2.3.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離得到的純菌株YX-1進(jìn)行部分生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表3。根據(jù)菌株YX-1的形態(tài)特征和生理生化特征，初步鑒定該菌為芽孢桿菌屬菌株。

2.3.3 16S rDNA序列分析

通過16S rDNA通用引物(27F/1492R)擴(kuò)增后進(jìn)行電泳分析如圖1。

將菌株YX-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測(cè)序，結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中使用Blast在GeneBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，選擇同源性較高的菌株16S rDNA進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖2。根據(jù)菌株YX-1的形態(tài)特征、生理生化特征鑒定結(jié)果，結(jié)合基于16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，將該菌鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。

圖1 菌株YX-1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果 Fig.1 Result of 16SrDNA PCR amplification of YX-1strain

圖2 菌株YX-1基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic tree of YX-1 strain based on 16S rDNA sequence identity

2.4 花生內(nèi)生菌YX-1的促生作用

2.4.1 內(nèi)生菌YX-1對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響

從表4可知，施用內(nèi)生菌YX-1不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液對(duì)花生幼苗地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和苗高與對(duì)照比均有不同程度的提高。當(dāng)施用稀釋倍數(shù)為1000倍的發(fā)酵液時(shí)，地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和苗高較對(duì)照分別提高44.05%、43.40%、27.76%和25.57%，且均達(dá)到顯著水平(p<0.05)，但根長(zhǎng)和苗高與施用其他稀釋倍數(shù)的處理之間差異不顯著(p>0.05)。

表4 內(nèi)生菌YX-1對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)結(jié)果

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理間差異顯著水平p<0.05。

Note: Different small letters in the same column indicate the significance level of difference atp<0.05.

2.4.2 蘇云金芽孢桿菌YX-1對(duì)葉綠素含量的影響

圖3可看出，施用不同稀釋濃度的花生內(nèi)生菌蘇云金芽孢桿菌，花生植株葉片葉綠素含量明顯高于對(duì)照。當(dāng)蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液稀釋1000倍時(shí)，葉綠素含量最高，達(dá)2.3972 mg·g-1FM，較對(duì)照提高38.19%，但與稀釋100倍和10000倍的處理差異不顯著(p>0.05)，而稀釋10倍的處理葉綠素含量顯著低于其他處理(p<0.05)。原因可能為稀釋倍數(shù)小，pH值高，導(dǎo)致沙土酸堿度高，從而改變了花生適宜生長(zhǎng)的酸堿度。

2.4.3 蘇云金芽孢桿菌YX-1對(duì)根系活力的影響

根系是植物的主要功能器官，可以從土壤中吸收水分和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。從圖4可知，不同稀釋倍數(shù)的蘇云金芽孢桿菌稀釋液對(duì)花生根系活力的影響較大。當(dāng)稀釋倍數(shù)為1000倍時(shí)，根系活力最大，為272.5 μg·g-1·h-1，顯著高于其他處理組和對(duì)照組(p<0.05)。說明蘇云金芽孢桿菌YX-1發(fā)酵液在適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)下能提高花生的根系活力。

2.4.4 內(nèi)生菌YX-1對(duì)花生保護(hù)酶活力的影響

表5可知，處理組和對(duì)照組根系中SOD酶活性都較低，但葉片中的SOD酶活性較高。當(dāng)稀釋倍數(shù)為1000倍時(shí)，花生根系和葉片中的SOD酶活性均最高，分別為20.15 U·g-1FM和255.74 U·g-1FM，均與對(duì)照和10倍處理差異顯著(p<0.05)，但與稀釋100倍至稀釋10000倍差異不顯著(p>0.05)。

圖3 不同稀釋倍數(shù)YX-1對(duì)葉綠素含量的影響

表5 不同稀釋倍數(shù)內(nèi)生菌YX-1對(duì)花生保護(hù)酶活力的影響

根和葉中POD酶活力除了施用10倍稀釋液的處理高于對(duì)照處理外，其他處理根和葉中POD酶活力均低于對(duì)照處理，但處理之間差異不顯著。

在稀釋倍數(shù)10～1000倍之內(nèi)，隨著稀釋倍數(shù)的增加，花生根系和葉片內(nèi)的CAT酶活性也隨之增加。當(dāng)稀釋倍數(shù)為1000倍時(shí)，根系和葉片中的CAT酶活性最高，分別為27.59 mgH2O2·g-1FM和32.89 mgH2O2·g-1FM，但稀釋倍數(shù)超過1000倍，CAT酶活性均下降，而且稀釋倍數(shù)在100～10000倍之間，CAT酶活性與對(duì)照比，差異顯著(p<0.05)。說明花生內(nèi)生菌蘇云金芽孢桿菌YX-1能提高花生植株體內(nèi)CAT酶活性。

3 討 論

3.1 內(nèi)生菌促生作用

內(nèi)生菌的促生長(zhǎng)作用主要是通過為宿主植物提供營(yíng)養(yǎng)、代謝產(chǎn)物、產(chǎn)生生長(zhǎng)激素和增強(qiáng)宿主的抗逆能力等[23]。研究表明，從霍山石斛中分離的甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)能顯著促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)[24]；從鹽生堿蓬中分離的內(nèi)生真菌Glomerellacingulata能促進(jìn)水稻幼苗生長(zhǎng)[25]；番茄內(nèi)生菌102能促進(jìn)番茄、青菜種子的萌發(fā)，對(duì)青菜、菠菜具有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)作用[26]；從花生根際中分離出1株高產(chǎn)植物生長(zhǎng)素的特基拉芽孢桿菌，能有效提高花生的產(chǎn)量[27]。本研究結(jié)果表明，施用不同濃度的花生內(nèi)生菌YX-1發(fā)酵液稀釋液，能顯著提高花生幼苗地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和苗高、根系活力、葉綠素含量，說明內(nèi)生菌YX-1發(fā)酵液在適當(dāng)稀釋倍數(shù)下能促進(jìn)花生生長(zhǎng)。

3.2 內(nèi)生菌對(duì)植株保護(hù)酶的影響

SOD、POD和CAT為植物抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的3個(gè)保護(hù)酶，在清除自由基、H2O2、過氧化物和減少羥基自由基等方面起到至關(guān)重要的作用[28]。國(guó)內(nèi)外研究逆境影響植株體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性報(bào)道較多[29-31]，但植物內(nèi)生菌對(duì)植物體內(nèi)SOD、POD和CAT活性的影響報(bào)道較少。本研究表明，花生內(nèi)生菌蘇云金芽孢桿菌YX-1發(fā)酵液在適當(dāng)稀釋度下能提高植株體內(nèi)SOD、CAT的活性，而POD活性隨內(nèi)生菌發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加而下降。

4 結(jié)論

從花生中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌YX-1，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征并結(jié)合16S rDNA序列分析將該菌鑒定為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；沙培試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)施用稀釋倍數(shù)為1000倍的發(fā)酵液時(shí)，地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和苗高較對(duì)照分別提高44.05%、43.40%、27.76%和25.57%，且均達(dá)到顯著水平(p<0.05)，幼苗葉片中葉綠素含量、根系活力較對(duì)照分別提高38.19%、42.08%，葉和根中的SOD、CAT顯著高于對(duì)照處理，而POD酶活力低于對(duì)照處理。