曾 蓉，徐麗慧，吳 雁，高士剛，劉 欣，戴富明

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所上海市設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201403)

稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌[Ustilasinoideavirens(Cooke)Tak]引起的一種穗部病害，是水稻上最常見的病害之一，發(fā)生遍布世界各水稻產(chǎn)區(qū)[1]。稻曲病菌有性階段為Villosiclavavirens(Cooke)Tak，侵染水稻后，能迅速充滿整個谷粒，致穎殼基部形成淺黃綠色的菌絲體小塊，后膨脹變?yōu)槟G色或深褐色[2-3]。稻曲病能造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，不僅導(dǎo)致水稻產(chǎn)量下降、品質(zhì)變差，還能在稻粒上產(chǎn)生Ustiloxin-A等6種毒素，人畜誤食后會引起食品安全問題[4-6]。因此控制水稻稻曲病的發(fā)生，對我國的水稻品質(zhì)及稻米生產(chǎn)安全顯得尤為重要。

目前，沈永安等[7]、Ashizawa等[8]認(rèn)為土壤中攜帶稻曲病菌，自然越冬的厚垣孢子可作為初侵染源。然而，黎毓干等[1]、 陳永堅(jiān)等[3]、劉見平等[9]認(rèn)為種子帶菌是稻曲病的初侵染源，自然感染稻曲病菌的種子的萌發(fā)會受到抑制[10-11]。所以，當(dāng)水稻種子混入稻曲病菌后，田間發(fā)生稻曲病的風(fēng)險增加。本試驗(yàn)建立了基于水稻稻曲病菌的特異性基因序列的PCR快速檢測方法，并對生產(chǎn)上的水稻種子進(jìn)行了快速檢測應(yīng)用，以期為上海市水稻稻曲病的監(jiān)測預(yù)警和快速診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：水稻稻曲病菌菌株由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所王艷麗贈送。水稻上其他參考菌株包括禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、新月彎孢菌(Curvularialunata)、厚膜孢鐮孢菌(Fusariumchlamydosporum)，細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)、鏈格孢(Alternariaalternata)、平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)、草莖點(diǎn)霉(Phomaherbarum)、黑孢菌(Nigrosporasp)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、Epicoccumsorghinum，墨汁鬼傘(Coprinopsisatramentaria)等由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

供試種子：上海生產(chǎn)上使用的水稻種子樣品(表1)。

表1 供試水稻種子樣品

試劑：Triton X-100，SDS，NaCl，Tris-HCl，EDTA等生化試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，Trans2K Plus II DNA Marker，瓊脂糖等分子生物試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司； Quick-DNA PlantSeed購自北京天漠科技開發(fā)有限公司。

1.2 方法

菌絲DNA按照Bust n’Grab方法提取[12]；待測水稻樣品利用Quick-DNA PlantSeed試劑盒(ZYMO)提取。

從GenBank下載U.virens基因組和非冗余數(shù)據(jù)庫((non-redundant database，nr)，應(yīng)用本地BLSATp把U.virens序列逐條與nr進(jìn)行比對，E-value設(shè)置為1×10-10。獲得特異性基因，從中挑選出合適的基因并根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物。選取引物對UV-788F(GACGATGTTCTGTCCTGTGCG)和UV-788R(GGCTCTTGAAAGGCGTTATCTG)為本研究的擴(kuò)增引物，擬擴(kuò)增Accession No.為KDB11756基因部分片段，其包括內(nèi)含子的序列大小約為788 bp。本研究還以胡茂林等[10]報道的特異性引物對UV279-F(CACACTCCGAAACCCCCCT)和UV693-R(CACATCATTTGCCCCCGTC)為參考，其擴(kuò)增的目的片段為415 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 退火溫度優(yōu)化及引物特異性

M：2k plus Marker； 1：55.0 ℃；2：55.7 ℃； 3：56.9 ℃； 4：58.8 ℃； 5：61.1℃； 6：63.0 ℃； 7：64.3℃； 8：65.0 ℃圖1 引物退火溫度試驗(yàn)Fig.1 The optimum annealing temperatures of UV-788FUV-788R primers

M：2k plus Marker； 1：U.virens；2：F.graminearum； 3：C.lunata； 4：F. chlamydosporum； 5：A.tenuissima； 6：A. alternate； 7：B.sorokiniana； 8：P. herbarum； 9：Nigrospora sp.； 10：R.solani； 11：F.moniliform； 12：E.sorghinum； 13：C.atramentaria；-：健康水稻種子圖2 引物特異性試驗(yàn)Fig.2 Primers specificity analysis of U.virens assay

2.2 檢測靈敏度

M：2k plus Marker； 1—11：200 ng—200×10-10 ng按1∶10梯度稀釋的11個DNA濃度模板；-：健康水稻種子；A：引物對UV-788FUV-788R； B：引物對UV279-FUV279-R圖3 PCR檢測靈敏度Fig.3 Sensitivity analysis for the detection of U.virens

2.3 種子樣品的檢測

以上海郊區(qū)水稻生產(chǎn)上使用的水稻種子樣品為檢測對象，利用引物對UV-788FUV-788R檢測種子水稻稻曲病的帶菌情況。PCR結(jié)果顯示被檢測的38個水稻樣品中有13個樣品顯示為陽性，其余為陰性，部分結(jié)果如圖4所示。

M：2k plus Marker； 1—22：1—22號種子樣品；-：健康水稻種子；+：U.virens DNA陽性對照圖4 種子樣品的PCR檢測Fig.4 PCR detection method application on rice seed

3 討論

病原真菌的準(zhǔn)確鑒定和早期檢測是植物病害防治的基礎(chǔ)。對于有些難于分離和純化的真菌病害，傳統(tǒng)的分離、檢測等不能在菌侵染初期作出快速準(zhǔn)確檢測，而分子生物學(xué)檢測技術(shù)可以對病菌進(jìn)行早期診斷及預(yù)警，從而可以有效抑制病原菌的傳播與病害流行。

真菌的rDNA的ITS(Internal Transcribed Spacer)序列由于其保守性和種特異性，已被廣泛的應(yīng)用于病原菌的鑒定及檢測中。但是，ITS序列的保守性往往導(dǎo)致不能特異的區(qū)分和鑒定病原物，故利用ITS序列設(shè)計(jì)引物困難。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對水稻稻曲病菌的全基因組與nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得該病原菌的特異性基因后，設(shè)計(jì)特異性引物用于檢測，避免了假陽性的可能。

本研究主要目的是建立水稻種子中稻曲病菌的PCR檢測技術(shù)，并將其應(yīng)用于田間或市售種子的檢測，最終應(yīng)用于病害的監(jiān)測及預(yù)警。周永力等[13-14]基于稻曲病菌ITS序列設(shè)計(jì)了巢式PCR引物，可用于稻曲病菌定性研究。林廷邦[15]也建立了水稻稻曲病PCR和巢式PCR的檢測方法，應(yīng)用于水稻植株和種子的帶菌檢測。鄭靜等[16]建立了水稻稻曲病的熒光定量PCR檢測方法，理論上最低可檢出24 fg的基因組DNA模板量及0.67個分生孢子。巢式PCR和熒光定量PCR檢測方法都能十分靈敏的用于病原菌的檢測，但巢式PCR有著耗時及易污染的弱點(diǎn)，熒光定量PCR也受限于昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。本研究建立的水稻稻曲病常規(guī)PCR檢測方法，為一種特異、靈敏、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測方法，為水稻稻曲病菌的檢測及種業(yè)健康發(fā)展提供了技術(shù)支持。