劉敏祥，鮑大鵬，何華奇，王 榮，汪 瀅*

(1國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2 安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，鳳陽233100)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(Fr.)Link]又名北蟲草或北冬蟲夏草[1]，因具有較高的藥用價值，在國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊的蛹蟲草保健食品目前已有40多種[2]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2015年度我國蛹蟲草產(chǎn)量達(dá)到7.4萬t。由于相應(yīng)的質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)還沒有出臺，消費者往往依據(jù)一些表觀指標(biāo)來衡量蛹蟲草子實體的價值。

市售蛹蟲草根據(jù)外觀形態(tài)可以分成“圓頭”和“尖頭”兩種類型，消費者通常認(rèn)為“圓頭”蛹蟲草營養(yǎng)和藥用價值高，因而相應(yīng)的價格也高；而認(rèn)為“尖頭”蛹蟲草營養(yǎng)和藥用價值低，價格也相對便宜[3]?，F(xiàn)有研究表明，蛹蟲草屬于二極性異宗配合真菌，只有不同交配型的單孢菌株混合培養(yǎng)才能產(chǎn)生含子囊殼和子囊孢子的成熟子座，但部分單孢菌株或者同一交配型的混合單孢菌株也能產(chǎn)生無子囊殼的子座[4-9]，分別對應(yīng)市場上“圓頭”和“尖頭”的蛹蟲草。

蛹蟲草的交配型由同源異型基因MAT-alpha和MAT-HMG控制。MAT-alpha基因包含兩個連鎖的交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2；MAT-HMG基因僅含有一個交配型基因MAT1-2-1[4]。通過鑒定MAT1-1-1和MAT1-2-1基因的有無就可確定蛹蟲草交配型。已有研究表明，培養(yǎng)條件[10-13]和菌落表型特征[14]均影響蛹蟲草蟲草素和腺苷的含量。盡管人工培養(yǎng)條件和菌落表型特征都影響蛹蟲草蟲草素和腺苷含量，但子實體的交配型與產(chǎn)量及主要活性物質(zhì)含量的關(guān)系未見報道。本試驗以收集的46株蛹蟲草菌株為材料，通過PCR鑒定交配型，并分析“圓頭”和“尖頭”兩種典型蛹蟲草主要的農(nóng)藝特征，以期為開展蛹蟲草育種和質(zhì)量檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗共收集46株蛹蟲草菌株，主要來源為遼寧、山東、江蘇等地，所有材料均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、水1 000 mL；沙氏液體培養(yǎng)基(美國BD公司)：沙氏培養(yǎng)基3 g、水100 mL；大米培養(yǎng)基：大米30 g、蠶蛹粉0.6 g、水45 mL。

1.3 蛹蟲草交配型鑒定

蛹蟲草交配型分子鑒定參考前期研究[15]，PCR反應(yīng)體系(20 μL)：Mix 10 μL，引物(表1)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55—60 ℃(溫度根據(jù)引物Tm確定)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 蛹蟲草交配型基因檢測引物

1.4 蛹蟲草栽培方法

在46株蛹蟲草平板邊緣處取綠豆大小菌塊接入搖瓶液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 rmin搖床培養(yǎng)10 d，無菌濾紙過濾得到孢子液，接種于大米培養(yǎng)基中，每瓶接入孢子液5 mL，每個菌株重復(fù)3瓶。25 ℃避光培養(yǎng)10 d，之后移入光照培養(yǎng)箱(10 h光照24 ℃，14 h黑暗22 ℃，濕度85%—90%)培養(yǎng)，直至采收[16]。

1.5 蛹蟲草農(nóng)藝品質(zhì)測定

待蛹蟲草子實體頂端膨大，不再增長，采下全部子實體統(tǒng)計單瓶鮮重，再于55 ℃干燥箱中烘6 h，取出稱干重。生物轉(zhuǎn)化率=子實體干重培養(yǎng)料鮮重×100%。

自接種日起至原基形成的天數(shù)即原基期時間，自接種日至采收時的天數(shù)即栽培周期。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌株交配型鑒定結(jié)果

蛹蟲草菌株交配型鑒定結(jié)果與其子實體“圓頭”和“尖頭”外觀表型完全對應(yīng)，分子鑒定含有兩種類型交配型基因的菌株其子實體頂端膨大，表面覆蓋毛刺即子囊殼，市場稱之為“圓頭”蛹蟲草(表2、圖1A)；而鑒定含有一種類型交配型基因的菌株其子實體頂端較尖細(xì)，表面光滑無子囊殼，市場稱之為“尖頭”蛹蟲草(表2、圖1B)。

表2 蛹蟲草菌株的交配型

圖1 兩種典型蛹蟲草 Fig.1 Two typical C.militaris

2.2 不同表型蛹蟲草農(nóng)藝特征分析

2.2.1 生長周期

參試46株菌株中有13株培養(yǎng)至80 d仍未形成原基和子實體，故僅統(tǒng)計33株可形成子實體的蛹蟲草農(nóng)藝性狀(圖2)?！皥A頭”(雙交配型)蛹蟲草平均原基期為17 d，栽培周期大多在65—70 d；而“尖頭”(單交配型)蛹蟲草平均原基期為19 d，栽培周期一般為70—75 d。SD2和FJ1兩株雙交配型菌株(“圓頭”型)不僅原基期最短，栽培周期也僅55 d；而“尖頭”蛹蟲草的栽培周期最短為62 d(中15)。

2.2.2 生物量

不同蛹蟲草菌株其子實體產(chǎn)量相差較大，單瓶鮮重為1.45—18.96 g，生物轉(zhuǎn)化率4.74%—61.96%，單瓶干重為0.22—3.22 g，子實體鮮重和干重比為3.58—10.47，可見不同蛹蟲草子實體含水量差異較大(表3)。“圓頭”蛹蟲草中，GD1菌株單瓶鮮重最高，但干重卻顯著低于FJ1菌株；“尖頭”蛹蟲草中，LN8菌株鮮重和干重均最高，但與LN4、LN5菌株沒有顯著差異。

圖2 不同交配型蛹蟲草栽培周期Fig.2 The culture cycle of different mating type C.militaris

菌株鮮重∕g·瓶-1干重∕g·瓶-1鮮重∕干重生物轉(zhuǎn)化率∕%“圓頭”GD118.61±0.13 a2.44±0.01 bc7.6360.82FJ217.01±0.90 b2.73±0.06 ab6.2355.59SD216.00±0.50 bc2.50±0.09 b6.4052.29FJ115.34±0.30 c2.86±0.14 a5.3650.13JS212.59±1.13 d2.20±0.38 c5.7241.14ST111.92±1.49 de1.63±0.20 d7.3138.95中1310.69±0.48 e1.65±0.14 d6.4834.93SD310.64±1.04 e1.64±0.21 d6.4934.77中126.08±0.43 f0.96±0.03 e6.3319.87中35.10±1.05 fg1.00±0.16 e5.1016.67LN25.05±0.53 fg0.58±0.07 f8.7116.50LN14.53±0.48 gh0.56±0.04 f8.0914.80中23.22±0.74 h0.50±0.06 f6.4410.52“尖頭”LN818.96±0.99 a3.22±0.11 a5.8961.96LN517.80±0.94 ab3.16±0.01 a5.6358.17LN417.52±0.60 abc3.22±0.10 a5.4457.25LN316.48±0.70 bc2.73±0.05 b6.0453.86YN116.06±1.59 c2.66±0.23 bc6.0452.48Cm01615.94±0.62 c2.00±0.20 e7.9752.09YN213.42±1.13 d1.64±0.10 gh8.1843.86LN1113.01±0.83 de2.28±0.12 d5.7142.52LN612.96±1.53 de2.03±0.10 e6.3842.35蟲112.59±1.02 de1.89±0.22 efg6.6641.14SD112.55±1.07 de2.45±0.27 cd5.1241.01LN911.75±1.20 def2.40±0.23 d4.9038.40

(續(xù)表1)

2.2.3 蟲草素和腺苷含量

參試蛹蟲草子實體中蟲草素含量差異較大，為0.320—4.776 μgmg(圖3)。“尖頭”蛹蟲草子實體中蟲草素含量(平均值2.599 μgmg)明顯高于“圓頭”蛹蟲草中蟲草素含量(平均值0.869 μgmg)，兩者間達(dá)到極顯著差異。栽培菌糠中蟲草素含量為0.177—3.013 μgmg，較子實體中蟲草素含量略微偏低，且“尖頭”蛹蟲草菌糠中蟲草素含量(平均值1.651 μgmg)與“圓頭”蛹蟲草菌糠中蟲草素含量(平均值1.007 μgmg)也具有顯著差異。

圖3 蛹蟲草子實體和菌糠中蟲草素含量Fig.3 The cordycepin content in C.militaris fruiting body and spent substrate

圖4 蛹蟲草子實體和菌糠中腺苷含量Fig.4 The adenosine content in C.militaris fruiting body and spent substrate

3 結(jié)論與討論

市售蛹蟲草根據(jù)外觀可以分成“圓頭”和“尖頭”兩種類型，目前對這兩種類型蛹蟲草之間的差異和成因的研究還很少。本研究發(fā)現(xiàn)“尖頭”蛹蟲草中蟲草素含量顯著高于“圓頭”蛹蟲草蟲草素含量，可為高蟲草素菌株選育和蛹蟲草質(zhì)量分級提供依據(jù)。

“圓頭”蛹蟲草栽培周期較“尖頭”蛹蟲草短5—10 d。較短的栽培周期，一方面可以提高栽培場所的利用效率，另一方面也會降低管理成本，增加經(jīng)濟(jì)效益。試驗發(fā)現(xiàn)，菌糠中蟲草素含量與子實體中含量相差不大，少數(shù)菌株菌糠中蟲草素含量反而高于子實體中含量，下一步應(yīng)積極探索菌糠綜合利用方式[17-18]，努力提高效益回報率，避免資源浪費。

“圓頭”蛹蟲草基本為雙交配型菌株，能進(jìn)行完整的生活史；而單交配型(“尖頭”蛹蟲草)菌株無法產(chǎn)生孢子，缺少有性生殖階段。本試驗中多數(shù)“尖頭”蛹蟲草子實體中蟲草素含量明顯高于“圓頭”蛹蟲草子實體中蟲草素含量，是否是由于有性生殖階段消耗了較多的營養(yǎng)物質(zhì)[19]，進(jìn)而導(dǎo)致蟲草素合成減少還有待進(jìn)一步驗證。無論是子實體還是菌糠，腺苷含量都較為穩(wěn)定。子實體中腺苷含量顯著高于菌糠中含量，是否是由于子實體是合成腺苷的主要組織或是菌絲合成的腺苷向子實體轉(zhuǎn)移的結(jié)果，有待進(jìn)一步研究。