夏義苗 陳復(fù)生 郝莉花 張麗芬 辛 穎

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450001）

植物油能為人體正常新陳代謝提供必需脂肪酸、脂溶性維生素、酚類(lèi)等有益物質(zhì)[1]，作為良好的烹飪媒介，是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡闹匾M成部分。2018年全球共種植大豆約12 295萬(wàn)hm2，其中78%為具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因大豆[2]，大豆油產(chǎn)量?jī)H次于棕櫚油，是世界第一大食品用植物油[3]。我國(guó)進(jìn)口大豆主要來(lái)源于美國(guó)、巴西和阿根廷等這些轉(zhuǎn)基因大豆種植大國(guó)[4-5]。由于我國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部規(guī)定轉(zhuǎn)基因大豆禁止直接用于人體可食用蛋白的加工，因此進(jìn)口大豆幾乎均被用于大豆油的生產(chǎn)，2018年我國(guó)大豆進(jìn)口約8 300萬(wàn)t，自產(chǎn)大豆約1 590萬(wàn)t，相應(yīng)大豆油消費(fèi)量高達(dá)約1 588 萬(wàn) t，遠(yuǎn)高于菜籽油（約 830 萬(wàn) t）、棕櫚油（約451 萬(wàn) t）和花生油（約 302 萬(wàn) t）等[2]，轉(zhuǎn)基因大豆油在我國(guó)植物用油中排首位。

隨著民眾對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆油關(guān)注度的持續(xù)高漲，我國(guó)相關(guān)政府部門(mén)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的建立和完善也愈加重視，科學(xué)完善的標(biāo)識(shí)制度不僅有助于促進(jìn)大豆油市場(chǎng)健康有序的發(fā)展，亦可使消費(fèi)者的知情權(quán)和自主選擇權(quán)得以保障[6-7]。標(biāo)識(shí)制度的順利執(zhí)行依賴(lài)于對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)基因食品精準(zhǔn)的檢測(cè)手段，不同的化學(xué)方法（同位素標(biāo)記、光譜、色譜等）和生物方法（DNA檢測(cè)等）均被大量嘗試應(yīng)用于食用油的品質(zhì)鑒定、溯源或轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，而油料作物的栽培地點(diǎn)、氣候和環(huán)境等因素的變化均會(huì)顯著改變油籽的化學(xué)成分組成，這使得基于化學(xué)方法的食用油檢測(cè)技術(shù)難以獲取用于區(qū)分的臨界值，且靈敏度有限[8-10]。而DNA檢測(cè)方法如PCR、real-time PCR等靈敏度高，特異性好，正在越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于食用油的摻偽、溯源及轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中[11-12]。近年來(lái)我國(guó)亦陸續(xù)出臺(tái)了多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)來(lái)引導(dǎo)DNA檢測(cè)技術(shù)在大豆油轉(zhuǎn)基因成分監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[13-16]。

DNA本身屬于水溶性分子，復(fù)雜的油脂精煉工藝、儲(chǔ)存過(guò)程、油脂氧化作用、核酸酶的存在等均會(huì)在不同程度上破壞DNA結(jié)構(gòu)[17-18]，被提取DNA中的蛋白、多酚、油脂或色素等殘留亦會(huì)抑制PCR等反應(yīng)[19-20]。為了提高被提取DNA的純度和數(shù)量，保障后續(xù)PCR等試驗(yàn)順利開(kāi)展，預(yù)防假陰性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)，本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的大豆油DNA提取方法進(jìn)行比較分析，將其有益經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)，以期促進(jìn)DNA檢測(cè)技術(shù)更好地服務(wù)于大豆油轉(zhuǎn)基因監(jiān)測(cè)工作，為政府標(biāo)識(shí)制度的完善和實(shí)施提供參考。

1 大豆油DNA提取方法

1.1 DNA水相濃縮

DNA屬于水溶性分子，因此往往需要向大豆油中加入水相，通過(guò)混合，使DNA分子進(jìn)入水相，將水油分離后針對(duì)水相進(jìn)行后續(xù)DNA純化操作。大豆油與水相在混勻過(guò)程中會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，使得水油分界面出現(xiàn)大量白色固體物，這將阻礙水油分離，也極易造成目標(biāo)DNA損失，因此部分研究者選擇在水油混勻過(guò)程中加入可與油相互溶的有機(jī)試劑，來(lái)促進(jìn)水油分離，這在水油二相總量較大的情況下應(yīng)用較普遍，當(dāng)大豆油和水相總體積小于2 mL，二者在2 mL離心管中進(jìn)行混勻、離心操作時(shí)，沒(méi)有有機(jī)試劑的參與水油兩相亦可分離良好。亦有研究者如Costa等[18]直接取200 g精煉大豆油在18 000×g、4℃下離心30 min，取離心所得沉淀進(jìn)行后續(xù)DNA純化試驗(yàn)。

水相提取液種類(lèi)眾多，既有十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、Nuclei lysis solution（Wizard試劑盒）和異硫氰酸胍等裂解液，也有適于溶解DNA的無(wú)菌水、TE或磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline，PBS）等。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，裂解液可直接與油相混合進(jìn)行DNA提取，亦可在水或TE溶液與油相混合、離心后，被加入到水相中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；無(wú)菌水、TE或PBS溶液與大豆油混勻離心后的水相可直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。裂解液的參與往往伴隨高溫如65℃水浴，而無(wú)菌水、TE或PBS溶液則不需要。

不同裂解液對(duì)大豆油DNA提取效率不一，聞偉剛等[21]比較了 2%CTAB、0.5%SDS、Nuclei lysis solution（Wizard試劑盒）和異硫氰酸胍裂解液從大豆油中提取DNA效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異硫氰酸胍裂解液與大豆油混溶，因而不適合大豆油DNA的提取，而其它3種裂解液效果相仿，均可從大豆原油中提取出DNA，而一級(jí)精煉大豆油PCR結(jié)果均呈現(xiàn)陰性；許冬倩等[22]比較了2%CTAB和20%SDS提取液對(duì)一級(jí)精煉大豆油DNA提取的適用性，結(jié)果顯示20%SDS裂解液提取的DNA可擴(kuò)增出35S 200 bp基因片段，而2%CTAB提取結(jié)果呈陰性，由此可知20%SDS裂解液對(duì)精煉大豆油DNA的提取效果優(yōu)于2%CTAB；He等[20]分別利用TE，2%CTAB，5%CTAB和1.4 mol/LNaCl溶液作為水相從精煉大豆油中提取DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2%CTAB溶液參與提取DNA后Lectin 118 bp片段PCR擴(kuò)增呈陰性，其它3種均呈陽(yáng)性，而TE參與提取的DNA擴(kuò)增信號(hào)較弱，5%CTAB和1.4 mol/L NaCl溶液相應(yīng)擴(kuò)增信號(hào)均較強(qiáng)。由此可知，作為精煉大豆油水相提取液2%CTAB和0.5%SDS效果相仿，TE溶液較之更好，然而均不如5%CTAB，20%SDS和1.4 mol/L NaCl溶液適用性好，不難發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高裂解液中表面活性劑濃度有利于精煉大豆油DNA的提取。

文獻(xiàn)報(bào)道中起始用油量差別較大，用量在1～500mL 不等[18，19，23]。 Bogani等[24]指出起始物料用量越大，越利于DNA的提取。周紅霞等[25]建議將精煉大豆油量增加至20 mL來(lái)滿(mǎn)足后續(xù)PCR檢測(cè)所需的DNA量。王澎等[26]將200 mL一級(jí)精煉大豆油和20 mL TE混合提取DNA，成功獲取Lectin 475 bp的目標(biāo)片段，巢式PCR可擴(kuò)增出EPSPS 110 bp和316 bp片段，而許冬倩等[22]用20 mL油和400 μL TE混合，又借助于20%SDS裂解作用，最終只從一級(jí)精煉大豆油中擴(kuò)增出200 bp的產(chǎn)物，由此可知起始油消耗量與終產(chǎn)品目標(biāo)DNA片段長(zhǎng)度具有正相關(guān)性，而這一結(jié)論也在He等[20]研究中得以證實(shí)。

用于降低水油混合過(guò)程中乳化作用，促進(jìn)水油分離的有機(jī)試劑主要有氯仿[24]、正己烷[23]、正庚烷[27]等。有機(jī)試劑可同時(shí)與大豆油、水相提取液混合，亦可先與大豆油混勻，再與水相提取液混合。He等[20]比較了正己烷、正庚烷和氯仿在精煉大豆油DNA提取中的適用性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種有機(jī)試劑參與均可成功檢測(cè)到被提取DNA Lectin 118 bp擴(kuò)增片段，而氯仿作用下的擴(kuò)增片段信號(hào)最強(qiáng)，且氯仿參與后混合液水油分離效果最好，因此作者推薦氯仿作為精煉大豆油DNA提取過(guò)程首選有機(jī)試劑。Bogani等[24]在用Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit從大豆毛油和脫膠油中提取DNA時(shí)，亦選用氯仿替代試劑盒推薦有機(jī)試劑正己烷來(lái)提高被提取DNA純度。

大豆油、水相和有機(jī)試劑比例亦會(huì)影響大豆油中DNA的提取效率。油與TE混合，使用最普遍的體積比是5∶2，隨后TE水相與CTAB裂解液體積比1∶1居多，與20%SDS裂解液體積比多為8 ∶1[22，25，28]。 食用油與有機(jī)試劑先混勻再與水相提取液混合時(shí)，農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4-2010關(guān)于油脂類(lèi)加工品DNA提取方法將正己烷與食用油以及水油體積比均設(shè)置為5∶6。He等[20]研究亦發(fā)現(xiàn)氯仿和食用油體積比接近1時(shí)DNA提取效果最好，具體到大豆油最佳體積比建議調(diào)整為5∶7，同時(shí)水油體積比建議值為5∶6。

1.2 DNA純化

1.2.1 水相直接沉淀法 大豆油中DNA被轉(zhuǎn)移入TE溶液后，可氯仿抽提，接著向上清液中加入異丙醇或無(wú)水乙醇沉淀DNA[26]，若此時(shí)DNA中油脂蛋白殘留量較多，可氯仿二次抽提，再加入異丙醇或乙醇沉淀[28]。若水相提取液使用PBS緩沖液，則需向水相提取液中加入硫酸銨溶液沉淀DNA[23]。

1.2.2 裂解液法 加熱后的CTAB或SDS裂解液均可用酚氯仿（體積比，1∶1）或氯仿異戊醇（體積比，24∶1）混合液進(jìn)行抽提，去除水相中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，抽提后的上清液可直接加入0.6倍體積異丙醇使DNA沉淀[22]。對(duì)于CTAB裂解液來(lái)說(shuō)，亦可向水相提取液中加入DNA沉淀液（0.04 mol/L NaCl），使DNA沉淀分離出來(lái)，再利用1.2 mol/L NaCl復(fù)溶DNA，隨后加入氯仿抽提，抽提后的上清液借助于0.6倍體積異丙醇沉淀出DNA[29]。如果裂解液是SDS提取液，則可向水相提取液中加入5 mol/L醋酸鉀溶液，冰浴30 min后離心取上清，加入異丙醇或無(wú)水乙醇沉淀DNA[22]。

CTAB法雖然較適合深加工食品DNA的提取[19，29]，但該法對(duì)試驗(yàn)者操作水平要求較高，如Nikolic等[30]指出CTAB法提取DNA結(jié)果隨機(jī)誤差較大，提高操作者熟練程度，避免過(guò)多樣品同時(shí)進(jìn)行DNA提取，可大大降低由操作帶來(lái)的隨機(jī)誤差。Ramos等[19]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)向CTAB裂解液中加入Tween20、蛋白酶K或PVP、β-巰基乙醇可提高被提取DNA純度，以利于后續(xù)進(jìn)行real-time PCR試驗(yàn)；延長(zhǎng)65℃水浴時(shí)間可提高被提取DNA數(shù)量，然而DNA純度相應(yīng)有所下降；另-20℃異丙醇沉淀DNA時(shí)間越長(zhǎng)，后續(xù)qPCR試驗(yàn)抑制物就會(huì)越多。因此利用裂解液法提取DNA時(shí)，不僅需熟練其操作，亦需對(duì)每一步執(zhí)行參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化來(lái)提高精煉油DNA提取效率。

1.2.3 核酸共沉劑法 核酸共沉劑法對(duì)于沉淀、回收低濃度DNA尤其有效，精煉油中DNA破壞嚴(yán)重、總量較少，因此該方法對(duì)于回收精煉大豆油DNA具有潛在可行性。該法應(yīng)用前期多采用TE溶液對(duì)油脂DNA進(jìn)行水相濃縮，接著分3步走進(jìn)行商業(yè)化核酸共沉劑法：即向水相中加入醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）（醋酸鈉和水相體積比，1∶10），混勻；加入助沉劑（助沉劑和水相體積比，1∶50或1∶100），混勻；加入乙醇或異丙醇沉淀DNA。很顯然TE水相體積直接決定后續(xù)醋酸鈉和助沉劑用量，而助沉劑價(jià)格往往較高，因此為了節(jié)省成本，前期TE水相用量就要控制，為了保證DNA提取足量，精煉大豆油原料用量要求不低于20 mL，為解決該難題操作者往往分多次將大豆油與TE溶液混合，每次將混合物離心后移除油相，剩余水相繼續(xù)與新油混合，如此重復(fù)，直至將全部大豆油原料中DNA轉(zhuǎn)入TE水相。許冬倩等[22]和周紅霞等[25]均用TE溶液對(duì)20 mL市售大豆油DNA進(jìn)行提取，并將水相提取液與等體積CTAB裂解液混合、水浴加熱，得到氯仿異戊醇（24∶1，體積比）抽提過(guò)的上清液后，二人分別采用異丙醇和核酸共沉劑法沉淀DNA，前者PCR檢測(cè)35S 200 bp片段結(jié)果呈陰性，后者則成功擴(kuò)增出了Lectin 118 bp、35S 195 bp、NOS 180 bp和EPSPS 320 bp 多條DNA片段，該結(jié)果說(shuō)明核酸共沉劑法對(duì)于精煉大豆油DNA的提取具有較好適用性。

亦有多數(shù)研究者利用助沉劑在酸性醋酸鈉和異丙醇混合液中進(jìn)行DNA沉淀[20，31-32]。可選助沉劑種類(lèi)眾多，如酵母tRNA、糖原、其它物種DNA、不同商業(yè)助沉劑等。周紅霞等[25]指出與大豆差異越大的物種，其DNA越適宜作為精煉大豆油DNA提取過(guò)程的助沉劑。助沉劑可在水油混合階段加入，亦可添加到水油分離后的水相中。He等[20]指出在水相中加入助沉劑更利于后續(xù)PCR檢測(cè)，且酵母tRNA較糖原、商業(yè)助沉劑等更適于精煉大豆油DNA的提取。

1.2.4 試劑盒法 Wizard Magnetic DNA PurificationSystem for Food Kit、Nucleospin Food Kit、DNeasy Plant Mini Kit等試劑盒均被嘗試用于大豆油DNA的提取，然而不同種試劑盒對(duì)大豆油DNA提取適用性不一。Pauli等[33]用Wizard試劑盒從壓榨大豆毛油中提取DNA，所得DNA量較充足，通過(guò)巢式PCR可得陽(yáng)性結(jié)果，而脫膠油DNA結(jié)果呈現(xiàn)陰性。Costa等[18]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論是借助于Wizard DNA purification resin還是利用Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit均不能從精煉大豆油中提取足量DNA用于PCR擴(kuò)增。油脂精煉程度越深，DNA破壞越嚴(yán)重，提取難度越大，這說(shuō)明Wizard試劑盒可能不適用于精煉大豆油DNA的提取。相較于Wizard試劑盒，Nucleospin Food Kit可成功從多種精煉大豆色拉油中提取DNA，Lectin基因PCR擴(kuò)增均呈現(xiàn)陽(yáng)性，其DNA提取效果甚至優(yōu)于傳統(tǒng)CTAB法[34]。Nikolic等[30]用 CTAB法和DNeasy Plant Mini Kit從大豆毛油中提取DNA，兩種方法均可獲取足量DNA，而試劑盒法提取的DNA純度更高，更適于后續(xù)PCR檢測(cè)，作者指出DNeasy Plant Mini Kit和Nucleospin Food Kit均是基于硅膠模吸附原理對(duì)DNA進(jìn)行純化，因此DNeasy Plant Mini Kit亦可能適用于精煉大豆油DNA的提取。

1.2.5 其它方法 程紅梅等[23]自行研發(fā)的離心柱法可從10 mL精煉大豆油中提取約0.4 μg DNA。白立群等[35]首次報(bào)道了冷凍干燥法在大豆油DNA提取中的應(yīng)用，作者指出大豆油DNA提取的關(guān)鍵步驟不是純化，而是將油脂中DNA進(jìn)行富集，該方法雖未從20 mL精煉大豆油中提出DNA，但該法DNA提取效率優(yōu)于Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit。

2 PCR試驗(yàn)

2.1 引物選取

油脂加工程度較深，PCR試驗(yàn)成功與否不僅與前期DNA提取過(guò)程有關(guān)，亦受后續(xù)引物選取的影響。周紅霞等[25]以相同的精煉大豆油DNA為模板，擴(kuò)增短鏈目標(biāo)片段如170 bp試驗(yàn)失敗，而當(dāng)選取GC堿基對(duì)含量較高的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可成功檢測(cè)到320 bp目的基因片段，因此對(duì)于深加工食品來(lái)說(shuō)選取GC含量高、穩(wěn)定性強(qiáng)的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可相對(duì)提高轉(zhuǎn)基因食品檢出率。

大豆卵磷脂工業(yè)加工過(guò)程為：大豆種子→破碎大豆→擠壓膨化大豆，接著進(jìn)行溶劑浸出，分別得到粗制大豆粉和毛油，粗制大豆粉→大豆蛋白粉，毛油→脫膠油→卵磷脂。Bogani等[24]系統(tǒng)的追溯了該過(guò)程中DNA的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆種子、破碎大豆、擠壓膨化大豆和粗制大豆粉均能擴(kuò)增 出 118，188，195，470，644，900 bp和1 006 bp共7條不同長(zhǎng)度的DNA片段，而大豆蛋白粉最長(zhǎng)只能擴(kuò)增644 bp DNA片段，毛油、脫膠油和卵磷脂最長(zhǎng)擴(kuò)增片段更小，只有470 bp，這說(shuō)明加工程度越深，DNA破壞越嚴(yán)重，對(duì)于深加工食品如精煉大豆油來(lái)說(shuō)，只有選取短片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物才可以提高DNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性，多數(shù)研究者建議將待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度限制在 200 bp 以下[19，32，36]。

2.2 PCR檢測(cè)

精煉大豆油加工程度深，DNA破損嚴(yán)重，利用核酸蛋白分析儀對(duì)被提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，A260/A280數(shù)值往往大幅偏離1.8，A260/A230數(shù)值多小于1，該結(jié)果表明被提取DNA純度低，所含抑制物較多，后續(xù)PCR試驗(yàn)可能很難開(kāi)展。然而Ramos等[19]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) A260/A280為1.02，1.16，0.78，0.86 等的食用油DNA均順利擴(kuò)增出了174 bp rbcl和548 bp trnl基因片段，這說(shuō)明被提取DNA紫外光譜檢測(cè)結(jié)果與后續(xù)PCR并沒(méi)有直接相關(guān)性，這也在Costa等[34]的試驗(yàn)中得以證實(shí)。因此，在轉(zhuǎn)基因精煉大豆油的檢測(cè)中，應(yīng)重點(diǎn)依據(jù)PCR或realtime PCR結(jié)果對(duì)DNA提取方法優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)判，并判定是否為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。

DNA中殘留的聚合酶抑制物可能降低PCR效率，造成假陰性誤判，Nikolic等[30]指出適當(dāng)稀釋DNA模板可降低PCR反應(yīng)抑制物濃度，促進(jìn)PCR試驗(yàn)順利進(jìn)行。為克服食用油DNA模板數(shù)量少，純度低等障礙，多種PCR相關(guān)技術(shù)，如巢式PCR、多重PCR、納米PCR[20]、毛細(xì)管電泳、生物傳感器[24]等技術(shù)均被報(bào)道用于精煉大豆油中轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)，以提高轉(zhuǎn)基因檢測(cè)準(zhǔn)確率。

3 油脂制取工藝對(duì)大豆油DNA的影響規(guī)律

完整的大豆油脂制取過(guò)程：大豆種子→清理→調(diào)質(zhì)→脫皮→軋坯→擠壓膨化→浸出得毛油和豆粕；毛油→脫膠→脫酸→脫色→脫臭得成品大豆油[37]。其中毛油精煉工藝涉及強(qiáng)堿NaOH、多次離心、洗滌、物理吸附、高于200℃高溫加熱等處理，這些操作均會(huì)對(duì)大豆油中DNA的完整度和殘留量造成影響[38-39]。因此為提高成品大豆油中DNA的提取效率，需充分了解和研究大豆油制取工藝對(duì)大豆種子DNA的具體降解規(guī)律。

Pauli等[33]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)向大豆毛油中加入水相、混勻、離心即可將毛油中DNA含量降低10 000倍甚至更多，此時(shí)脫膠大豆油中DNA含量已低于檢測(cè)限，再經(jīng)過(guò)后續(xù)其它精煉工藝，轉(zhuǎn)基因大豆精煉油與傳統(tǒng)大豆油已具有等同性，無(wú)需轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)。Gryson等[40-41]亦指出脫膠是將DNA從毛油中移除的最有效步驟，且脫膠溫度、時(shí)間和酸液pH等因素對(duì)DNA移除效果影響不大，然而考慮到DNA提取方法與檢測(cè)結(jié)果具有直接相關(guān)性，因此作者也提出改進(jìn)DNA提取方法，如增大脫膠油用量以使油脂中轉(zhuǎn)基因檢測(cè)具有潛在可行性。

與以上結(jié)論相反，Costa等[34]利用Nucleospin Food Kit從不同階段的工業(yè)精煉大豆油中提取DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆種子→清理→破碎→軋坯→擠壓膨化→大豆粕全程均可測(cè)得118 bp Lectin和169 bp EPSPS DNA片段，同時(shí)毛油→中和油→水洗油→脫色油→脫臭油均可測(cè)得Lectin 103 bp DNA片段，卻只有毛油和脫臭油可測(cè)得106 bp EPSPS DNA片段；real-time PCR結(jié)果相仿，大豆固體樣品均可檢測(cè)到81 bp Lectin和83 bp EPSPS DNA擴(kuò)增片段熒光信號(hào)，然而只有毛油、中和油和脫臭油可測(cè)得內(nèi)外源DNA片段熒光信號(hào)，其中中和油DNA拷貝數(shù)低于檢測(cè)限。以上結(jié)果說(shuō)明脫膠工藝并沒(méi)有完全移除大豆毛油中殘留DNA，脫臭油中DNA含量不減反升，具體原因有待后續(xù)研究探討，這為利用DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)精煉大豆油進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等提供了可行性理論支撐。

4 展望

目前DNA檢測(cè)技術(shù)在食用油中應(yīng)用最廣泛的是橄欖油和大豆油[11，42]，其中橄欖油DNA檢測(cè)在國(guó)外研究較多，主要用于產(chǎn)地溯源和摻偽檢測(cè)，而大豆油DNA檢測(cè)則主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)，我國(guó)是轉(zhuǎn)基因大豆油消費(fèi)大國(guó)，尤其應(yīng)注重和提高大豆油轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。

大豆油DNA提取工作難度較大，Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit、Nucleospin Food Kit和DNeasy Plant Mini Kit等試劑盒均大量被嘗試用于食用油DNA的提取，當(dāng)前NucleospinFood Kit已被報(bào)道成功用于工業(yè)精煉大豆油DNA的追溯，然而這些進(jìn)口試劑盒價(jià)格較昂貴，并不適用于國(guó)內(nèi)大批量大豆油轉(zhuǎn)基因評(píng)定工作。因此國(guó)內(nèi)研究者應(yīng)致力于低成本、易操作、耗時(shí)短DNA提取技術(shù)的開(kāi)發(fā)，考慮到不同種油脂最適DNA提取方法不同，可針對(duì)大豆油研發(fā)適用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的平價(jià)試劑盒。

國(guó)內(nèi)大豆油精煉工藝與國(guó)外略有不同，兩者對(duì)脫膠和脫酸步驟的劃分不一樣，目前還沒(méi)有關(guān)于完整大豆油制取工藝對(duì)大豆DNA降解規(guī)律的研究報(bào)道，尤其是國(guó)內(nèi)的大豆油制取工藝，后續(xù)研究應(yīng)彌補(bǔ)這塊缺失，并探討適用于監(jiān)測(cè)油脂精煉過(guò)程中DNA變化的基因片段，針對(duì)該片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，來(lái)提高轉(zhuǎn)基因大豆油檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確率。