杜雯,王中偉，孟凡冰,，李云成,*，劉達(dá)玉,，余華，彭鐮心

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106)

醬油是一種以大豆、小麥或麩皮為原料釀造的一種具有獨(dú)特醬香且營(yíng)養(yǎng)豐富的調(diào)味品。醬油的釀造工藝主要分為低鹽固態(tài)發(fā)酵法和高鹽稀態(tài)發(fā)酵法兩種[1]。在醬油的發(fā)酵成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)、淀粉等的簡(jiǎn)單分解及有機(jī)成分間復(fù)雜的酶解與合成過(guò)程，產(chǎn)生大量的小分子化合物，構(gòu)成醬油的風(fēng)味[2]。除此之外，風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生還與醬醪中的微生物活動(dòng)息息相關(guān)，酵母菌直接或間接地參與了醬油中的酒精發(fā)酵、酸類發(fā)酵和酯化作用等[3]，通過(guò)代謝組學(xué)對(duì)低分子量代謝產(chǎn)物的綜合研究發(fā)現(xiàn)，這些反應(yīng)既可減少醬油中的一些不良風(fēng)味，又可促進(jìn)醬油風(fēng)味更加豐富和柔和[4]。此外，某些酵母菌的發(fā)酵作用對(duì)4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)、4-乙基苯酚、2-乙基-4-羥基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMF)等醬油特征性風(fēng)味物質(zhì)的積累有重要影響[5]。然而，酵母菌在醬油高鹽釀造過(guò)程中生長(zhǎng)緩慢或不能生長(zhǎng)，因此能夠選育出高耐受性(耐鹽、耐溫、耐酸)的酵母菌株對(duì)醬油品質(zhì)的提高有重要意義。

1 醬油釀造產(chǎn)香酵母的種類

目前，醬醅中可分離出7個(gè)屬，32個(gè)種的酵母菌，工業(yè)上用于醬油發(fā)酵的酵母菌主要包括作為主發(fā)酵酵母的魯氏酵母和賦予醬油特定香氣成分的球擬酵母(也稱后發(fā)酵酵母)，也有部分假絲酵母可作為后發(fā)酵酵母運(yùn)用于醬油生產(chǎn)中[6,7]。

1.1 魯氏酵母

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)具有良好的耐鹽性能，在18%食鹽濃度下仍能生長(zhǎng)，在24%食鹽濃度下生長(zhǎng)弱，向醬醪中添加VB5、VB7、肌醇、膽堿能夠促進(jìn)魯氏酵母在高食鹽濃度下生長(zhǎng)[8]。在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中魯氏酵母作為主發(fā)酵酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵作用，通過(guò)糖酵解途徑(EMP途徑)生成乙醇，也可同釀酒酵母一樣通過(guò)埃利希途徑利用不同支鏈氨基酸合成相對(duì)應(yīng)的芳香雜醇如異戊醇、活性戊醇、異丁醇等[9]。郭建等[10]接種魯氏酵母CICC1417后能顯著提高醬醪中的HEMF含量。Meng等[11]研究表明，魯氏酵母發(fā)酵能夠產(chǎn)生2-呋喃甲硫醇和2-巰基丙酸乙酯，其對(duì)日系醬油的風(fēng)味有著重要作用。另外，隨著發(fā)酵溫度的升高，魯氏酵母自溶促進(jìn)了后熟酵母如易變圓酵母、多變假絲酵母、球擬酵母等的生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生4-EG、4-乙基酚、HEMF等香味物質(zhì)[12,13]。

1.2 球擬酵母

球擬酵母也是一種在高滲透壓下仍能生長(zhǎng)的耐鹽性酵母，屬于后發(fā)酵酵母，起產(chǎn)酯增香的作用，主要形成4-乙基苯酚(4-EP)、4-EG和2-苯乙醇等香氣成分，同時(shí)酵母菌體在發(fā)酵后期發(fā)生自溶，呈鮮味的核酸類物質(zhì)的含量增加[14]。在醬油中添加球擬酵母可相對(duì)縮短生產(chǎn)周期，有效提高醬油品質(zhì)。球擬酵母還可產(chǎn)生酸性蛋白酶，在發(fā)酵后期對(duì)未分解的肽鏈進(jìn)一步水解，提高醬油的鮮味。醬油發(fā)酵常用的球擬酵母主要有三類：易變球擬酵母(Torulopsisversatilis)、埃契氏球擬酵母(Torulopsisetchellsii)和蒙奇球擬酵母(Torulopsismogii)[15]。酈平爾等[16]在采用瀘釀2.14球擬酵母改善低鹽固態(tài)淋澆發(fā)酵的醬油品質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，得出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)是在發(fā)酵21 d時(shí)添加1.4%的球擬酵母，并調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度至32 ℃，其醬油氨基酸態(tài)氮含量平均值為1.43 g/dL，與預(yù)測(cè)值(1.44 g/dL)偏差小于2%，具有較好的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1.3 假絲酵母

假絲酵母(Candidaversatilis)是一類發(fā)酵能力較弱的酵母，有氧條件下能夠生長(zhǎng)繁殖，無(wú)氧條件下能夠發(fā)酵乙醇。假絲酵母自身能夠合成甘油，同時(shí)還能從環(huán)境中吸收甘油，因此具有很高的耐鹽性，在高鹽條件下能發(fā)酵麥芽糖生成乙醇，同時(shí)還能產(chǎn)生酚類化合物，如賦予醬油丁香香味和煙熏味的4-EG和4-乙基酚等。曹小紅等[17]研究耐鹽酵母添加對(duì)高鹽稀態(tài)醬醪風(fēng)味成分的影響時(shí)表明，在醬醪發(fā)酵第45天時(shí)添加假絲酵母可以提高醬油中主要酯類、醇類及醛類的含量且HEMF的含量也可明顯提高。Feng等采用兩步醬油接種法向高鹽稀態(tài)醬油中接種假絲酵母，可有效提高醬油的氨基酸態(tài)氮、無(wú)鹽固形物及揮發(fā)性風(fēng)味成分。

2 醬油釀造產(chǎn)香酵母的選育技術(shù)

目前存在的天然酵母抗逆性差，耐鹽、耐酸、耐高溫性能差，因此需要通過(guò)選育得到性狀穩(wěn)定、耐性較好的菌株。食品微生物育種的方式主要有誘變育種、基因組重排等；近年來(lái)，原生質(zhì)體融合技術(shù)也在不斷發(fā)展，逐漸得到廣泛應(yīng)用；進(jìn)化工程選育作為一種新興的選育技術(shù)也在逐步應(yīng)用于微生物的選育中。

2.1 誘變育種

誘變育種是指運(yùn)用物理或化學(xué)的方式，誘導(dǎo)微生物的遺傳特性發(fā)生變異，再?gòu)淖儺惖娜后w中選擇符合人們某種要求的單株菌體，進(jìn)而培育成為新的品種的育種方式。誘變育種具有操作簡(jiǎn)單、易重復(fù)、操作過(guò)程不會(huì)引入外源基因等優(yōu)勢(shì)，保證了食品的安全性，因而廣泛應(yīng)用于食品微生物的選育中[18]。

物理誘變利用紫外線、X射線、α射線、β射線、γ射線、激光、微波、離子注入等物理方式提高生物的自然突變率。其中，紫外誘變因其危險(xiǎn)性低、設(shè)備簡(jiǎn)單成為實(shí)驗(yàn)室最常用的物理誘變手段?；瘜W(xué)誘變是利用一些化學(xué)誘變劑(烷化劑、堿基類似物、嵌入劑、某些無(wú)機(jī)化合物等)來(lái)提高生物的自然突變率的育種方式。常用的烷化劑有甲基磺酸乙酯(EMS)和亞硝基胍(NTG)；常用的堿基類似物有6-嗅尿嘧啶、馬來(lái)酰肼、2-氨基嘌呤等；常用的嵌入劑有溴化乙錠(EB)，可嵌入堿基分子中導(dǎo)致錯(cuò)配；常用的無(wú)機(jī)化合物主要有氯化鋰、亞硝酸鹽、過(guò)氧化氫等[19]。Tekarslansahin等[20]通過(guò)EMS誘變獲得耐鹽釀酒酵母菌株，鹽濃度最高可達(dá)8.5%。有時(shí)單一的突變方式并不能得到我們想要的性狀，宋茜[21]將經(jīng)過(guò)紫外照射與EMS誘變處理后高鹽平板篩選得到的突變?nèi)后w作為出發(fā)菌株，結(jié)合基因組重排和高鹽培養(yǎng)基篩選，得到的菌株H3-8耐鹽性由12%提高到20%，并且大量產(chǎn)生乙醇、乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)。

總的來(lái)說(shuō),誘變育種在操作上方便，對(duì)設(shè)備要求低，可行性高，但是存在變異方向不受控等缺陷，因此提高誘變效率，迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑，是當(dāng)前研究的重要課題。

2.2 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合，又稱為細(xì)胞融合，指通過(guò)人為的方法將兩個(gè)或兩個(gè)以上遺傳性狀不同的細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行接觸，使得發(fā)生細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的方法[22]。原生質(zhì)體融合的過(guò)程一般分為原生質(zhì)體的形成、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體的再生與選擇3個(gè)階段。Lee等[23]在3.0%的EMS中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的方法篩選出魯氏酵母ZRM-83和釀酒酵母SCM-46的營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變型菌株魯氏酵母M-12和釀酒酵母M-43，發(fā)現(xiàn)在0.05 mg/mL的消解酶中培養(yǎng)60 min后，兩個(gè)兩種菌株的原生質(zhì)體融合效果更好，用20%聚乙二醇6000處理30 min后融合效率和融合頻率均顯著提高，且這些來(lái)源于兩種原生質(zhì)體的融合子具有細(xì)胞大、DNA含量高的特性。

相對(duì)于常規(guī)的誘變育種，原生質(zhì)體融合技術(shù)用于微生物育種的目的性強(qiáng)，成功的機(jī)率較大，單親滅活原生質(zhì)體融合法大大提高了篩選的效率。由于它所具有的受接合型的限制較小、遺傳物質(zhì)更加完整、雜交頻率高等一系列特點(diǎn)，原生質(zhì)體融合技術(shù)越來(lái)越被國(guó)內(nèi)外酵母選育專家和其他微生物育種學(xué)者廣泛研究和應(yīng)用。

2.3 Genome Shuffling技術(shù)

基因組重排首先通過(guò)傳統(tǒng)誘變方法對(duì)性狀優(yōu)良的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，通過(guò)誘變來(lái)篩選不同優(yōu)良正突變的菌株建立突變體庫(kù)，然后將這些突變體的基因通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)發(fā)生隨機(jī)重組融合，經(jīng)過(guò)多輪遞推原生質(zhì)體融合，眾多優(yōu)良性狀的基因就可以集中在同一菌株，因此可高效率、快速地篩選到性狀得到較大提升的融合菌株[24]。王春玲等[25]通過(guò)基因組改組從釀酒酵母AS21182中獲得的S3-4菌株耐鹽性從100 g/L提高到180 g/L，且乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙醇和乙酸等物質(zhì)的含量均得到有效提高。Cao等[26]經(jīng)過(guò)三輪基因組重組，從醬油魯氏酵母中篩選出一株抗鹽性較強(qiáng)的突變體S3-2，此突變體加速了醬油風(fēng)味的形成時(shí)間，經(jīng)檢測(cè)，乙酸乙酯含量是對(duì)照組的2.38倍，HEMF含量提高了75%，基因組重組法成功改善醬油風(fēng)味。Cao等[27]也對(duì)異常漢遜氏酵母(Hansenulaanomala)中一株耐鹽性較強(qiáng)的突變株H3-8進(jìn)行了三輪基因組重組篩選，結(jié)果表明H3-8可以在含鹽量17%的YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且能在較寬的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)，此外，H3-8中的HEMF產(chǎn)量是魯氏酵母的6.3倍，由H3-8生產(chǎn)的乙酸乙酯是易變球擬酵母的734倍。4-EG的產(chǎn)量比易變球擬酵母的增加了10.84%。

經(jīng)基因組重排改造后的酵母菌株可有效提高產(chǎn)物產(chǎn)量以及對(duì)環(huán)境的耐受性，改善底物的利用率和范圍，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物或提高酵母遺傳多樣性，且可穩(wěn)定遺傳。在未來(lái)，基因組重排將會(huì)推動(dòng)酵母菌株育種工程的發(fā)展，優(yōu)良性狀的酵母菌種將會(huì)在食品釀造領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用前景。

2.4 進(jìn)化工程選育

進(jìn)化工程(evolutional engineering)是為了獲得某個(gè)既定表型菌株，在人工提供選擇壓力的條件下通過(guò)模擬自然進(jìn)化中的生物變異和選擇過(guò)程使微生物進(jìn)化，然后從進(jìn)化的菌群中篩選出性狀優(yōu)良的菌株的方法[28]。目前進(jìn)化工程在工業(yè)酵母的選育上研究較多，研究者不僅能夠通過(guò)進(jìn)化工程得到性能有所提高的表現(xiàn)型菌株，同時(shí)在關(guān)鍵酶作用和代謝途徑的研究方面取得了一定的進(jìn)展[29]。利用醬油釀造的環(huán)境壓力(如食鹽濃度、pH、溫度等)加速目標(biāo)菌株產(chǎn)生適應(yīng)性進(jìn)化，大大提高了菌株的抗逆性，因此其在耐鹽性、耐酸性和耐溫性產(chǎn)香酵母的選育方面具有很好的應(yīng)用前景。馮杰采用批次馴化的方法將埃切假絲酵母的耐鹽濃度從180 g/L提高到240 g/L，且能明顯提高醬油中HEMF、4-羥基-2,5-二甲基-3-呋喃酮(HDMF)和4-EG等關(guān)鍵風(fēng)味化合物質(zhì)含量，顯著改善醬油的風(fēng)味品質(zhì)。在菌種選育過(guò)程中，進(jìn)化工程還可以與誘變育種相結(jié)合，通過(guò)誘變產(chǎn)生大量的突變文庫(kù)，然后利用外加壓力進(jìn)行選擇性篩選，把負(fù)向突變或目標(biāo)性狀較弱的突變體加以淘汰，增加正向突變的篩選成功率[30]。然而，目前關(guān)于產(chǎn)香酵母的進(jìn)化工程選育的研究報(bào)道還很少，但相信未來(lái)該方法會(huì)在醬油產(chǎn)香酵母選育領(lǐng)域加以利用。

3 小結(jié)與展望

總的來(lái)說(shuō)，近年來(lái)有關(guān)醬油產(chǎn)香酵母菌的選育研究越來(lái)越受到重視。目前產(chǎn)香酵母的選育多采用誘變育種的方式來(lái)進(jìn)行特定性狀菌株的選育，雖然此方法對(duì)設(shè)備要求低、方便、易操作，但是突變方向往往不確定，因此需要利用更好的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)菌株性能的定向改變。原生質(zhì)體融合、基因組重排以及進(jìn)化工程的方法在工業(yè)釀酒酵母的選育中有著較為廣泛的應(yīng)用，但是在醬油發(fā)酵產(chǎn)香酵母的選育研究中還相對(duì)較少，技術(shù)尚不成熟。因此，在今后的研究中可加大技術(shù)開發(fā)力度，通過(guò)這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)香酵母中香味物質(zhì)的大量積累。同時(shí)，還需加大基礎(chǔ)研究，深入探究產(chǎn)香酵母風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理，為實(shí)現(xiàn)產(chǎn)香酵母合理代謝工程(rational engineering)改造奠定基礎(chǔ)。