龍 敏，沈 遐，劉 芳，俞建妹，包 晗

(南寧樹(shù)木園，廣西 南寧 530031)

1 引言

金花茶(CamellianitidissimaC. W. Chi)，屬于山茶科山茶屬，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種開(kāi)金黃色的山茶花，是世界珍稀觀賞樹(shù)種和種質(zhì)資源，與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴“植物活化石”齊名，被譽(yù)為“植物界的大熊貓”，“茶族皇后”。金花茶除了有觀賞價(jià)值外，藥用和保健價(jià)值也被人們廣泛認(rèn)可，此外，還含有特殊的色澤遺傳基因，具有較高的科研價(jià)值[1]。隨著金花茶價(jià)值不斷被開(kāi)發(fā)利用，市場(chǎng)上對(duì)金花茶苗木的需求不斷增加，而其傳統(tǒng)的種子和扦插繁殖育苗材料有限、育苗周期長(zhǎng)[2]，因此金花茶組織培養(yǎng)技術(shù)研究就成了其發(fā)展的新風(fēng)向。國(guó)內(nèi)對(duì)金花茶組織培養(yǎng)相關(guān)研究已有一些報(bào)道。莊承紀(jì)和程金水等從金花茶子葉誘導(dǎo)胚狀體再生成完整植株；廖漢刃等以莖段為外植體成功培育出試管無(wú)根苗并與油茶苗砧嫁接形成完整植株，繼代增殖率2.8～6.2；顏慕勤等研究了廣西7種金花茶組織培養(yǎng)技術(shù)，驗(yàn)證了適合大多數(shù)茶科的基本培養(yǎng)基為改良ER培養(yǎng)基，并成功應(yīng)用于雜交金花茶幼胚的早期培養(yǎng)；黃昌艷等以防城港金花茶種胚誘導(dǎo)成功培育出組培苗，增殖系數(shù)3.79，并進(jìn)行壯苗培養(yǎng)后直接移栽；李桂娥等建立了金花茶組培快繁體系，增殖系數(shù)4.2，生根率達(dá)86%?？梢?jiàn)，金花茶組織培養(yǎng)研究已取得一定進(jìn)展，但仍有待完善。本試驗(yàn)旨在研究影響金花茶組織培養(yǎng)芽增殖生長(zhǎng)的幾種因素，為金花茶組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

2 材料與試驗(yàn)方法

2.1 材料

供試材料來(lái)源于廣西南寧樹(shù)木園金花茶基因庫(kù)中優(yōu)選的生長(zhǎng)健壯、花朵繁多,花產(chǎn)量較高的金花茶植株當(dāng)年生嫩枝，通過(guò)莖段消毒滅菌、初代培養(yǎng)獲得的組培繼代芽。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度配比對(duì)芽的增殖

在Q (MS+50 mg/L Na2SO4)的基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用雙因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加不同濃度6-BA(2.0 mg/L 、3.0 mg/L、 4.0 mg/L)配以IAA和NAA，后兩者濃度梯度均為0 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L。每處理接種10瓶(500 mL三角瓶，以下試驗(yàn)相同)，每瓶接種6叢叢芽(5～7顆芽/叢，以下試驗(yàn)同)，重復(fù)3次，接種40 d統(tǒng)計(jì)芽增殖情況。

2.2.2 不同濃度水解酪蛋白對(duì)不定芽的增殖

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加水解酪蛋白，濃度梯度為0 mg/L ，100 mg/L,300 mg/L,500 mg/L,700 mg/L,900 mg/L。每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復(fù)3次，接種40 d觀察記錄芽增殖數(shù)量和質(zhì)量的情況。

2.2.3 芽褐化現(xiàn)象的遏制

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+CH 300 mg/L培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加核黃素15 mg/L、抗壞血酸10 mg/L和活性炭500 mg/L，每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復(fù)3次，接種40d觀察記錄芽增殖過(guò)程中的褐化情況。

2.2.4 溫度條件對(duì)不定芽的增殖

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+CH 300 mg/L+抗壞血酸10 mg/L培養(yǎng)基上接種健壯繼代芽，置于不同培養(yǎng)溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)的溫度梯度為15～20℃、21～25℃、26～30℃，每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復(fù)3次，接種后不斷觀察繼代芽生長(zhǎng)情況。

2.3 培養(yǎng)條件

上述所有培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L，瓊脂4.5 g/L，pH值5.8，培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓( 121 ℃，0.14 MPa) 滅菌15 min。除試驗(yàn)外，繼代芽在光照強(qiáng)度800～2000 Lx的條件下培養(yǎng)7～10d,再置于4000～6000Lx的光照條件下培養(yǎng)，光照時(shí)間12～14 h/d，培養(yǎng)室溫度21～25 ℃。光照主要來(lái)源于太陽(yáng)散射光。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Office Excel 2007，SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。公式如下：

芽增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種芽總數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度配比對(duì)金花茶組培芽增殖的影響

在組織培養(yǎng)中，人工添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比，會(huì)共同影響芽增殖的數(shù)量和生長(zhǎng)情況。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

序號(hào)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA(A)IAA(B)NAA(C)芽增殖系數(shù)12002.25221.004.37320.50.55.524301.010.52530.50.59.32631.00.59.89740.51.07.588401.06.81941.005.09K112.1419.5811.71K229.7322.4224.73K319.4819.3524.91k14.056.533.90k29.917.478.24k36.496.458.30極差5.861.024.40最佳組合A2B1C3

表2主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)因變量y

源III 型平方和自由度均方F值P值校正模型61.180a610.19761.3150.016截距418.2021418.2022514.7470.0006-BA(A)14.29527.14842.9800.023IAA(B)2.60521.3027.8310.113NAA(C)7.19223.59621.6250.044誤差0.33320.166總計(jì)479.7159校正的總計(jì)61.5138

由表1和表2的檢驗(yàn)結(jié)果綜合分析表明，因素A和因素C的P值為0.023和0.044，都小于0.05，說(shuō)明6-BA和NAA對(duì)芽增殖的作用顯著，其中起主導(dǎo)作用的是6-BA，其次是NAA，兩者協(xié)同作用，是影響金花茶芽增殖的重要因素。因素B的P值為0.113，大于0.05，顯示IAA在試驗(yàn)各水平中對(duì)金花茶芽增殖作用不顯著，這可能是由于IAA在植物體內(nèi)運(yùn)輸緩慢導(dǎo)致。試驗(yàn)結(jié)果顯示最佳的組合為A2 +C3+B1即6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+IAA0 mg/L，其平均增殖系數(shù)最高為10.52。

由表3多重比較可知，6-BA的水平2和1、3水平差異顯著，1、3水平間差異不顯著，6-BA濃度以3.0 mg/L芽增殖效果最好，芽平均增殖系數(shù)達(dá)9.910，試驗(yàn)中最高芽增殖系數(shù)達(dá)13。NAA水平2、3和水平1差異顯著，2、3水平之間差異不顯著，NAA的水平3與6-BA的水平2濃度配比增殖效果最好。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中單純添加細(xì)胞分裂素6-BA2.0 mg/L繼代芽有一定的增殖，但是芽密集粗短，玻璃化嚴(yán)重。這說(shuō)明一定濃度的細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的分化，但欲使芽生長(zhǎng)良好，在繼代培養(yǎng)過(guò)程中必須要有生長(zhǎng)素協(xié)同作用。

表3 金花茶芽增殖單因素方差分析結(jié)果

3.2 水解酪蛋白對(duì)芽增殖的影響

水解酪蛋白含有氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其作為一種有機(jī)添加物被廣泛應(yīng)用于組織培養(yǎng)中[3]，對(duì)不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芽增殖系數(shù)較高的培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽高生長(zhǎng)緩慢，活性不強(qiáng)，為了促進(jìn)芽健康生長(zhǎng)，本試驗(yàn)在上述Q+6-BA3.0mg/L+NAA1.0 mg/L組合的基礎(chǔ)上添加不同濃度的CH,培養(yǎng)40d芽形態(tài)變化、新芽增殖和芽的生長(zhǎng)狀況詳見(jiàn)表4。

表4 不同濃度水解酪蛋白對(duì)芽增殖影響

表4結(jié)果顯示，不同濃度的CH對(duì)芽增殖和生長(zhǎng)效果不一致，增殖系數(shù)大小排序?yàn)镃H-4>CH-3>CH-2>CH-1>CK>CH-5，其中CH-2、CH-3、CH-4的芽增殖系數(shù)較高，分別為12、13、15，當(dāng)濃度低為CH-1時(shí)，芽的長(zhǎng)勢(shì)差，增殖系數(shù)偏低；CH-4芽增殖系數(shù)雖然最大，但芽粗短密集，容易出現(xiàn)玻璃化，CH-3芽增殖系數(shù)也較高，但繼代芽連續(xù)培養(yǎng)3代后，同樣也出現(xiàn)玻璃化芽；當(dāng)濃度達(dá)到CH-5時(shí)，芽粗短且玻璃化嚴(yán)重最后褐化死亡。因此試驗(yàn)結(jié)果表明較為適宜的水解酪蛋白添加濃度為CH-2(即300 mg/L)，其增殖芽生長(zhǎng)健康，扦插生根率高。

3.3 不同添加物對(duì)芽褐化現(xiàn)象遏制的效果

金花茶組培芽在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，芽體褐化現(xiàn)象比較明顯。褐化是完整組織和細(xì)胞受到物理傷害，酚類化合物外溢，在酶作用下迅速氧化，形成褐色醌類物質(zhì)，進(jìn)一步與組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導(dǎo)致組織代謝紊亂，甚至死亡的現(xiàn)象[4]。褐化是植物組織培養(yǎng)中常見(jiàn)的問(wèn)題，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，添加適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┗蛭絼┛梢赃_(dá)到降低或抑制褐化的作用。

本試驗(yàn)在上述試驗(yàn)優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加核黃素15 mg/L、抗壞血酸10 mg/L以及活性炭500 mg/L，并在接種后每天觀察記錄芽體褐化的程度和芽的生長(zhǎng)情況，接種40 d各添加物對(duì)芽褐化遏制的效果見(jiàn)圖1。

圖1 不同添加物對(duì)芽褐化的遏制效果

圖1中，輕度褐化表示接種后單顆芽頂芽褐化，褐化部分小于1/3；中度褐化表示單顆芽的1/3～1/2褐化；重度褐化表示單顆芽的1/2以上褐化。

圖1顯示培養(yǎng)基中添加15 mg/L核黃素對(duì)抑制芽的褐化效果不明顯，全部出現(xiàn)不同程度的褐化，其中輕度褐化的芽?jī)H占瓶?jī)?nèi)芽數(shù)的5%，而中度、重度褐化共占95%，以中度褐化為主；添加抗壞血酸，無(wú)褐化和輕度褐化占97%，表明10 mg/L抗壞血酸對(duì)金花茶繼代芽的增殖過(guò)程中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象抑制效果較好；添加活性炭可在一定程度上抑制褐化，無(wú)褐化占25%，輕度褐化占26%，中度、重度褐化占49%，其對(duì)褐化的抑制作用仍低于抗壞血酸，且活性炭雖然能夠吸附芽體釋放的褐化物質(zhì)，但也會(huì)吸附培養(yǎng)基的有效成分。由此可見(jiàn)，添加抗壞血酸10 mg/L遏制芽褐化的效果比較理想。

3.4 溫度對(duì)金花茶芽生長(zhǎng)的影響

適宜的溫度是保障植物正常生長(zhǎng)的重要條件。金花茶性喜溫涼但懼炎熱的環(huán)境。本試驗(yàn)將接種的繼代芽置于不同溫度條件下培養(yǎng)40d芽增殖和生長(zhǎng)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5顯示，T1溫度15～20℃條件下繼代芽增殖系數(shù)偏低，芽生長(zhǎng)緩慢，原因可能是因長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)室溫度偏低導(dǎo)致植株的生理活性降低；T2溫度21～25℃條件下芽的增殖系數(shù)最高達(dá)12.3，芽生機(jī)勃勃，平均株高3.8 cm，是最適合金花茶組培芽的增殖和生長(zhǎng)的溫度范圍；當(dāng)溫度提高到26～30 ℃時(shí)，繼代芽接種第3 d即有葉片發(fā)黃現(xiàn)象，第7 d后逐漸出現(xiàn)枯葉落葉，甚至整株芽的葉片全部落光至死，大部分的繼代芽無(wú)新芽增殖，因此，芽的增殖系數(shù)最低，分析其原因主要是培養(yǎng)溫度過(guò)高導(dǎo)致植株體內(nèi)代謝紊亂，生長(zhǎng)失衡。

3 結(jié)論與討論

隨著6-BA濃度提高，芽增殖系數(shù)先上升后下降，試驗(yàn)中6-BA濃度3.0 mg/L的增殖系數(shù)最高，這與黃昌艷(2016)在金花茶種子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)研究結(jié)果相類似，本試驗(yàn)還研究了6-BA與生長(zhǎng)素協(xié)同作用于金花茶組培芽的增殖，增殖系數(shù)10以上，就增殖系數(shù)而言，較優(yōu)于國(guó)內(nèi)有關(guān)的金花茶組織培養(yǎng)研究結(jié)果。

表5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)金花茶組培芽增殖和生長(zhǎng)

對(duì)于金花茶組培芽褐化的遏制，抗壞血酸的作用優(yōu)于核黃素和活性炭，因?yàn)榭箟难崾且环N普遍存在于植物組織的抗氧化物質(zhì)，其作為自由基消除劑，可以成為初級(jí)抗氧化物直接清除單線態(tài)氧、超氧化物和羥自由基[5]，而植株體產(chǎn)生的酚類化合物正是由羥自由基與芳烴核(苯環(huán)或稠苯環(huán))直接相連形成的有機(jī)化合物，因此添加抗壞血酸能較好的與酚類化合物結(jié)合，阻止醌類褐化物質(zhì)產(chǎn)生，因而起到調(diào)節(jié)金花茶組培芽體內(nèi)的氧化還原代謝的作用，同時(shí)基本上對(duì)培養(yǎng)基的有效成分無(wú)影響，因此選擇抗壞血酸作為添加物以抑制芽體的褐化效果良好。

金花茶喜歡溫涼環(huán)境，本試驗(yàn)最適溫度范圍21～25 ℃，在實(shí)際生產(chǎn)中要同時(shí)考慮到成本問(wèn)題，尤其是高溫季節(jié)室外溫度一般在28～35 ℃，培養(yǎng)室溫度長(zhǎng)期控制在21～25 ℃耗電大成本高，因此是否可以將溫度基本控制在25 ℃±2 ℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)金花茶組培芽能否正常生長(zhǎng)，有待進(jìn)一步研究。