伍維高,鐘金鳳

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院,湖南 衡陽 421005)

近幾年來,動物疫病肆意流行,免疫接種成為預防傳染病的有效措施之一,而免疫反應過程相當復雜,諸多因素會影響接種效果,如免疫抑制性疾病、不良的飼養(yǎng)環(huán)境、微量元素和蛋白質的缺乏等,常導致免疫接種失敗,給生產(chǎn)帶來不可挽回的重大損失。為提高機體抗病力,增強動物免疫力,免疫增強劑得以廣泛運用。為了進一步研究此類制劑,人為構建免疫抑制模型的研究手段得到了諸多研究者的青睞。而環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),以其誘導動物產(chǎn)生免疫抑制作用效果顯著,且成本低廉,越來越廣泛地運用到制備動物免疫抑制模型中。為此,本文對環(huán)磷酰胺構建免疫抑制模型進行綜述。

1 環(huán)磷酰胺的藥理作用

經(jīng)口服或靜脈注射的環(huán)磷酰胺主要在肝臟進行代謝,生成低毒性的4-羥基環(huán)磷酰胺和醛磷酰胺,分布全身,進一步降解為磷酰氮芥、丙烯醛和去甲氮芥,結合于快速生長細胞的DNA上,產(chǎn)生強烈的細胞毒性。極少部分可進一步氧化成4-酮環(huán)磷酰胺和羧基環(huán)磷酰胺,無毒性,隨尿排出[1]。

2 CTX免疫抑制機理

2.1 環(huán)磷酰胺對免疫基因的影響

2.1.1 抑制抗菌蛋白基因表達 內源性抗菌蛋白是天然免疫的重要組成部分,其中殺菌/滲透增強蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI)、防御素(Defensins,DF)以及血小板型磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)備受關注[2]。大鼠連續(xù)5 d腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg·bw,對照組注射等體積生理鹽水,結果顯示,對照組大鼠的睪丸、附睪、胸腺、肝、小腸、大腸6種器官均表達BPI、β-DF-1、血小板型PLA2;而環(huán)磷酰胺組胸腺、肝無BPI表達,睪丸、胸腺、肝無β-DF-1表達,睪丸、胸腺無血小板型PLA2表達,其他有表達的組織中其含量比對照組低[3],試驗提示,環(huán)磷酰胺可抑制體內抗菌蛋白基因表達。

2.1.2 影響免疫相關基因的表達 環(huán)磷酰胺對免疫相關基因有一定影響。經(jīng)環(huán)磷酰胺處理的荷瘤鼠脾臟、骨髓和血漿相關多種免疫調節(jié)因子基因上調,包括危險信號、模式識別受體、炎癥介質、生長因子、細胞因子、趨化因子和趨化因子受體[4]。通過基因芯片技術檢測環(huán)磷酰胺干預的胚胎干細胞發(fā)現(xiàn)：自體免疫激活和移植排斥相關基因如CD3、CD28、CTLA4、MHC II、PRF1、GZMB 和 IL-2R 基因下調,而免疫相關受體基因如IL1R2、IL18R1和FLT3上調[5]。

2.2 環(huán)磷酰胺對動物轉錄水平的影響

2.2.1 抑制骨髓細胞相關mRNA表達 環(huán)磷酰胺誘導骨髓抑制,造成骨髓細胞(BM)降低。雄性昆明種小鼠連續(xù)3d腹腔注射150 mg/kg·d環(huán)磷酰胺,7 d后采骨髓細胞通過Real time PCR檢測發(fā)現(xiàn),試驗組BM細胞鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor,CaSR)和絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)mRNA水平極顯著高于對照組(P＜0.01),引起B(yǎng)M造血干細胞、間充質干細胞和內皮祖細胞增殖、分化和動員產(chǎn)生明顯障礙[6]。

2.2.2 調節(jié)細胞凋亡相關mRNA表達 環(huán)磷酰胺對細胞凋亡的影響主要體現(xiàn)在兩方面：增加促凋亡基因mRNA表達而抑制抗凋亡基因mRNA表達,從而誘導細胞凋亡。SPF級NIH雄性小鼠于試驗期第9、11、13天腹腔注射環(huán)磷酰胺 10 mg/kg,于 14 d、28 d取脾臟采用半定量RT-PCR檢測促凋亡基因-Caspase-9 mRNA和抗凋亡基因-B淋巴細胞基因2(B-cell lymphonma gene 2,BCL-2)的表達,兩次結果均顯示,模型組Caspase-9 mRNA表達較對照組顯著升高而BCL-2 mRNA表達顯著降低[7]。8～12周遠交系昆明種小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg,1次/d,連續(xù)3 d,第10天取小鼠脾臟測定凋亡相關基因,結果顯示,BAX(Bcl-2 associated X protein)mRNA表達水平明顯上升,而BCL-2 mRNA表達明顯下降[8]。

2.2.3 降低免疫相關受體mRNA表達 環(huán)磷酰胺可降低免疫相關受體mRNA的表達。樹突狀細胞相關C-型凝集素-1(Dectin-1)和Toll樣受體(Tolllike receptor,TLR)主要表達在免疫細胞上,為免疫相關受體,與免疫狀態(tài)有關[9]。給予150 mg/kg環(huán)磷酰胺的BALB/c小鼠與第4、7、9天取肺組織測定Dectin-1 mRNA,結果顯示,在第4、7天肺組織Dectin-1 mRNA表達較對照組明顯下降(P＜0.05)[10]。24只昆明種小鼠(雌性)腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg/kg,4 h后肺泡巨噬細胞TLR2 mRNA表達與對照組相比極顯著下降(P＜0.01);8 h后TLR4 mRNA表達極顯著降低(P＜0.01)[11]。

2.2.4 影響免疫因子mRNA表達 環(huán)磷酰胺對Th1、Th2類細胞因子mRNA表達均有不同程度影響。汪禎等[12]用SPF級昆明種小鼠按50 mg/kg·bw劑量隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺,共7次,14 d后,無菌取脾臟測定IL-2 mRNA、IL-10 mRNA,結果顯示,IL-2 mRNA、IL-10 mRNA表達水平與對照組相比顯著下降;易有金等[13]腹腔注射40mg/kg·d環(huán)磷酰胺,結果顯示,脾臟和胸腺中 IL-2、IL-10、IL-12、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的表達量降低,以上試驗提示,環(huán)磷酰胺對Th1、Th2類細胞因子表達均呈現(xiàn)下調現(xiàn)象[14]。

2.3 環(huán)磷酰胺對動物蛋白水平的影響

2.3.1 抑制細胞周期相關蛋白表達 環(huán)磷酰胺降低著絲粒蛋白B(Centromere Protein,CenpB),CenpB是染色體著絲粒/動粒復合體上一種最重要的功能蛋白,其特異性結合位點位于著絲粒 α1-衛(wèi)星DNA上17 bp的CenpB盒,參與著絲粒異染色質的形成,環(huán)磷酰胺可致CenpB蛋白含量異常,致細胞無法正常分裂。昆明種小鼠連續(xù)7 d腹腔注射50 mg/kg·bw環(huán)磷酰胺,5 d后取血通過Western Blotting方法檢測 CenpB蛋白,其含量顯著低于對照組[15]。

2.3.2 增加細胞凋亡相關蛋白表達 環(huán)磷酰胺可通過增加細胞凋亡蛋白的表達影響Fas/Fas L系統(tǒng)介導的凋亡蛋白。SPF級ICR純種雄性小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg·bw,用流式細胞術檢測Fas抗原(CD95)介導細胞凋亡的蛋白,其表達量與對照組相比顯著升高[16]。人T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat加入環(huán)磷酰胺 3 mg/L,于12、24、48 h 收取細胞,Western Blot檢測FasL(Fas ligand,fas配體)和FADD(Floationg Point Addition,胞漿死亡信號銜接蛋白)表達,結果表明,未處理的細胞無 FasL和FADD表達,而環(huán)磷酰胺處理組表達FasL和FADD,且表達水平隨環(huán)磷酰胺刺激時間延長而增加[17]。除此,環(huán)磷酰胺能顯著誘導Fas/Fas L下游蛋白Caspases產(chǎn)生[18],使凋亡不可逆進行。

3 環(huán)磷酰胺在動物上的應用

因環(huán)磷酰胺主要作用于快速生長細胞的DNA,并能從基因轉錄、翻譯和蛋白表達等多方面產(chǎn)生細胞毒性。免疫細胞屬于快速生長細胞,因此,環(huán)磷酰胺對免疫系統(tǒng)影響甚大,故可用環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑構建免疫抑制模型,這是環(huán)磷酰胺在動物上的主要用途。

3.1 環(huán)磷酰胺抑制動物免疫器官 在環(huán)磷酰胺作用下雞表現(xiàn)出形態(tài)退行性改變,包括腔上囊囊泡不發(fā)達,即腔上囊初級濾泡嚴重萎縮,皮質和髓質間隔不明顯且濾泡間結締組織嚴重增值[19]。Marsh J研究發(fā)現(xiàn),脾臟內正常橢球相關細胞在環(huán)磷酰胺作用后1周變?yōu)榭张輀20]。

3.2 環(huán)磷酰胺降低動物免疫細胞數(shù)量 連續(xù)3 d給7～8周齡雌性尼古拉斯火雞注射環(huán)磷酰胺(0～100 mg/kg·bw),測定血液學指標發(fā)現(xiàn),環(huán)磷酰胺在初始注射后24～72 h引起明顯的白細胞減少、淋巴細胞減少、血小板減少和白細胞減少。但對單核細胞循環(huán)數(shù)、細胞體積、血漿蛋白無明顯影響。同時,無法確定對嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的變化,因為它們在機體內的數(shù)量微量[21]。

3.3 環(huán)磷酰胺減少免疫分子產(chǎn)生 研究表明,環(huán)磷酰胺可減少免疫分子產(chǎn)生：用80 mg/kg·bw環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠,同位素標記法顯示24 h和48 h其腸道蛋白損失顯著高于對照組,連續(xù)2 d注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg·bw),可造成腸黏膜SIgA損傷,腸道固有層IgA表達量減少[22]。環(huán)磷酰胺(10 mg/kg·bw)與單劑量長春新堿(0.025 mg/kg·bw,靜脈注射)和單劑量的 L-天冬酰胺酶(400 IU/kg·bw,靜脈注射)同時注射狗,3 d后抗體反應受抑制[23]。

環(huán)磷酰胺在抑制免疫系統(tǒng)的同時,其他新陳代謝旺盛的組織如胃腸、毛發(fā)等亦會受影響,因此,用環(huán)磷酰胺造模的同時,動物可出現(xiàn)采食量降低、生長性能受阻、毛發(fā)脫落等現(xiàn)象[24-25]。

4 小結

環(huán)磷酰胺主要作用快速生長細胞DNA,并從基因水平、轉錄水平和蛋白水平影響免疫系統(tǒng),它可下調抗菌蛋白基因、免疫相關基因的表達,增加促凋亡基因mRNA和抑制抗凋亡基因mRNA轉錄,降低著絲粒蛋白B含量,抑制細胞正常分裂;誘導促凋亡蛋白Caspases產(chǎn)生,促使凋亡不可逆進行,從而廣泛引起細胞周期改變、誘導細胞凋亡發(fā)生,最終表現(xiàn)出免疫器官、免疫細胞和免疫分子的現(xiàn)象,可廣泛應用在動物免疫抑制模型上。