張鴻飛,秦酈,蔣水星,畢付提,劉玲,張建華,王德培,*
(1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津300457;2.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津300457;3.天津科技大學生物工程學院,天津300457;4.山東日照金禾博源生化有限公司,山東日照276800)
檸檬酸是一種重要的有機酸,在食品工業(yè)、精細化工洗滌和化妝品行業(yè),醫(yī)藥業(yè)[1-4]等市場需求大,并以每年3%~5%需求量遞增。我國是檸檬酸生產(chǎn)大國,2017年產(chǎn)量達到152萬噸,是全球重要的檸檬酸生產(chǎn)國和出口國。
目前檸檬酸發(fā)酵大都以玉米為原料,經(jīng)過高溫噴射液化,以帶渣玉米液化液為培養(yǎng)基進行檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)。由于每批玉米營養(yǎng)成分存在很大差別,從而造成檸檬酸生產(chǎn)不穩(wěn)定;此外,帶渣玉米液化液黏稠溶氧較差,需加大通風壓力,生產(chǎn)能耗大[5];由于玉米渣中存在大量不被發(fā)酵利用的固形物,影響發(fā)酵過程精細控制,也造成提取相對困難。因此,帶渣玉米液化液發(fā)酵工藝亟待改變。以玉米清液進行檸檬酸發(fā)酵,有其獨特的優(yōu)點。玉米粉液化去渣后,液化液中脂肪、蛋白質(zhì)含量低,發(fā)酵醪液黏度低利于溶氧,降低能耗縮短發(fā)酵周期,提高轉(zhuǎn)化率;發(fā)酵液固形物少,濾液清,油脂少,有利于從檸檬酸發(fā)酵液中提取檸檬酸,提高回收率和產(chǎn)品質(zhì)量;且液化后得到的濾渣可用于制備高品質(zhì)的玉米蛋白飼料[6],增加企業(yè)經(jīng)濟收益。因此,進行檸檬酸清液發(fā)酵新型工藝研究,降低檸檬酸生產(chǎn)成本,具有重大意義。
本論文以營養(yǎng)成分相對穩(wěn)定的玉米液化清液為原料,確定了檸檬酸生產(chǎn)的最佳生產(chǎn)條件,并進行中試生產(chǎn),為大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 試驗菌株
黑曲霉(Aspergillus.niger)CGMCC1042:由天津科技大學微生物保藏中心保藏。
1.1.2 試劑
無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、大豆蛋白胨 (分析純):天津市北方天醫(yī)試劑公司;FeSO4(分析純):天津市四通化工廠;肌醇(分析純):上海權(quán)旺生物科技有限公司;玉米漿(試劑級):金豐玉米有限公司;α-淀粉酶(40 000 U/mL):諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):馬鈴薯削皮切塊,稱取200 g,加入適量蒸餾水煮沸30 min,4層紗布過濾除渣,取清液加蒸餾水定容至1 L,加入2%葡萄糖充分溶解,加入瓊脂粉20 g,加熱充分溶解分裝斜面后,121℃,20 min滅菌。
玉米液化清液的制備:玉米粉與水以1∶4(g/mL)的比例混合,攪拌均勻后加熱到70℃,加入耐高溫的α-淀粉酶(0.5 kg/t),保溫10 min后加熱到90℃保溫4 h~5 h,趁熱經(jīng)兩層紗布過濾得糖化清液。過濾清液冷卻后加水調(diào)整總糖到要求的濃度[7]。
種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基:總糖10%的玉米液化清液,0.25%(NH4)2SO4,0.15%KH2PO4,500 mL 三角瓶裝液量 40 mL,121℃滅菌20 min。
發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:總糖17%的玉米液化清液,0.2%KH2PO4,0.15%(NH4)2SO4,0.025%MgSO4,500 mL三角瓶裝液量50 mL,121℃滅菌20 min。
OLYMPUS 719068光學顯微鏡:OLYMPUS公司;LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;FA2004N電子天平:上海精密科學儀器有限公司;DELTA320 pH計:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HZQ-QX恒溫振蕩器:中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;WYT-J總糖計(0~32%):成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司;HDL超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司;30 L發(fā)酵罐:上海高機生物工程有限公司。
1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化試驗
1.3.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基有機氮源種類單因素試驗
初糖濃度為17%的玉米液化清液添加0.15%(NH4)2SO4,在氮含量相同的前提下,以0.92%玉米漿、0.5%大豆蛋白胨、0.65%酵母粉、0.6%飼料蛋白作為有機氮源分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。按10%接種量,330 r/min,36.5℃,搖床培養(yǎng)72 h,每組做兩個平行試驗,以最終產(chǎn)酸量及菌絲球形態(tài)為因變量,得出最佳的有機氮源并優(yōu)化其添加量。
1.3.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基添加玉米漿單因素試驗
以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在玉米液化清液中添加 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、1.2%、1.4%的玉米漿,另外添加0.15%(NH4)2SO4。按10%接種量,330 r/min,36.5℃,搖床培養(yǎng)72 h,每組做兩個平行試驗,測定最后的產(chǎn)酸量,確定玉米漿最終添加量。
1.3.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基添加(NH4)2SO4單因素試驗
糖濃度為17%的玉米液化清液,分別添加0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%(NH4)2SO4。按 10%接種量,330 r/min,36.5℃,搖床培養(yǎng)72 h,每組做兩個平行,以最終產(chǎn)酸量為因變量,得出最佳的(NH4)2SO4添加量。
1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基添加肌醇單因素試驗
糖濃度為17%的玉米液化清液,分別添加肌醇終濃度0、0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.009%。按10%接種量,330 r/min,36.5℃,搖床培養(yǎng) 72 h,每組做兩個平行,以最終產(chǎn)酸量及菌絲球形態(tài)為因變量,得出最佳的肌醇添加量。
1.3.1.5 發(fā)酵培養(yǎng)添加不同金屬離子正交試驗
對發(fā)酵培養(yǎng)基中 MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO46種金屬元素進行L27(36)正交試驗。按10%接種量,330 r/min,36.5℃,搖床培養(yǎng)72 h,每組做兩個平行,以最終產(chǎn)酸量為因變量,通過方差分析以確定6種金屬元素的最佳配比。正交試驗因素及水平表見表1,正交試驗因素的水平由單因素試驗確定。
表1 正交試驗設(shè)計各因素及水平Table 1 Levels of factors used in the orthogonal experimental design
1.3.2 玉米清液最佳發(fā)酵條件試驗
1.3.2.1 初糖含量對檸檬酸產(chǎn)量的影響
調(diào)整玉米液化清液初糖濃度分別為16%、17%、18%、19%、20%,按10%的接種量,控制發(fā)酵溫度36.5℃,攪拌轉(zhuǎn)速 400r/min,通風 400L/h,罐壓 0.1 MPa,進行發(fā)酵。發(fā)酵開始每隔8小時分別從各個不同初糖濃度的發(fā)酵罐中取樣,測定檸檬酸產(chǎn)量和發(fā)酵液pH值,放罐后進行菌絲體凈重測量,記錄凈重變化,以及殘還原糖測定。
1.3.2.2 種齡對檸檬酸產(chǎn)量的影響
選取培養(yǎng) 18、20、24、27 h 的種子液進行試驗,接種量為10%,測定最終檸檬酸產(chǎn)量,放罐后進行菌絲體凈重測量,記錄凈重變化以及殘還原糖測定。
1.3.2.3 溶氧對檸檬酸產(chǎn)量的影響
采用30 L全自動通風機械攪拌發(fā)酵罐進行發(fā)酵,調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度18%,調(diào)節(jié)初始pH 3.5。通風量調(diào)整如下:
方案A分三段控制通氣量:0~16 h:300 L/h,轉(zhuǎn)速300 r/min;17 h~48 h:450 L/h,轉(zhuǎn)速 450 r/min~500 r/min;49 h~58 h:350 L/h,轉(zhuǎn)速 300 r/min。
方案B發(fā)酵全程大通風量:0~60 h:450 L/h,轉(zhuǎn)速450 r/min~500 r/min;61 h~64 h:350 L/h,轉(zhuǎn)速 300 r/min。
1.3.2.4 檸檬酸產(chǎn)量的測定
取1mL發(fā)酵上清液于250mL三角瓶中,添加1滴~2滴酚酞做指示劑,用濃度為c的NaOH標準溶液滴定至淡粉色,30 s后不褪色[85],讀取消耗NaOH標準溶的體積為V,則檸檬酸產(chǎn)量計算公式為:
式中:Y為檸檬酸產(chǎn)量,以一水檸檬酸計量,g/100 mL;c為NaOH標準溶液物質(zhì)的量濃度,mol/L;V為NaOH標準溶液消耗體積,mL;0.142 9為滴定系數(shù)。
1.3.2.5 還原糖的測定
本試驗采用費林試劑熱滴定法,費林試劑由甲、乙兩種溶液組成,滴定時以亞甲基藍為指示劑。
1)空白滴定
準確吸取費林試劑甲液和乙液各5 mL于250 mL錐形瓶中,滴加約19 mL葡萄糖標準溶液,加熱使其在2 min內(nèi)沸騰,準確沸騰30 s,趁熱以每2秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標準溶液,直至溶液藍色剛好褪去為終點。記錄消耗葡萄糖標準溶液的總體積。平行操作3次,取其平均值V1。
2)發(fā)酵液還原糖的測定
樣品溶液測定:取費林試劑甲液、乙液各5 mL,置于250 mL錐形瓶中,用移液管吸取經(jīng)適當稀釋后發(fā)酵濾液0.1 mL置于錐形瓶中,加入2滴次甲基藍指示劑,從滴定管中加入比與測試樣品溶液消耗的總體積少1 mL的樣品溶液,加熱使其在2 min內(nèi)沸騰,準確沸騰30 s,趁熱以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液,滴定時要保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液由藍色變淺時,以每2秒1滴的速度滴定,直至溶液的藍色剛好褪去為終點。記錄樣品溶液消耗的體積,平行操作3次,取其平均值V2,計算公式為:
式中:V為標定時平均消耗還原糖樣品溶液的總體積,mL;N為還原糖樣品溶液的稀釋倍數(shù);1 000為mg換算成g的系數(shù)。
1.3.2.6 產(chǎn)酸率的測定
式中:產(chǎn)酸率為檸檬酸生產(chǎn)速率,g/(100 mL·h);Y為檸檬酸產(chǎn)量以一水檸檬酸計量,g/100 mL;t為發(fā)酵時間,h。
2.1.1 不同有機氮源種類的選擇
不同有機氮源[8]對黑曲霉檸檬酸發(fā)酵,菌絲球形態(tài),糖酸轉(zhuǎn)化率等具有顯著的影響,結(jié)果如圖1、圖2所示。
圖1 不同有機氮源對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.1 The influence of different types of organic nitrogen sources on the production of citric acid
圖2 添加不同有機氮源發(fā)酵液菌絲球形態(tài)Fig.2 The mycelium pellet morphology after adding different organic nitrogen sources
由圖1可知,4種氮源對于產(chǎn)酸量的影響先后順序為玉米漿>大豆蛋白胨>蛋白飼料>酵母粉,添加玉米漿時產(chǎn)酸量最高可達9.27 g/100 mL,糖酸轉(zhuǎn)化率均高于其它氮源,并且殘還原糖相對較少,大豆蛋白胨次之,添加玉米漿和大豆蛋白胨發(fā)酵性能優(yōu)于添加其他有機氮源。由圖2可知,添加玉米漿和大豆蛋白胨時的菌絲球形態(tài)較好,菌絲球大小較為均一,菌絲擴散較少;添加酵母粉時的菌絲球形態(tài)不規(guī)則,且菌球直徑偏大;添加飼料蛋白時的菌絲球直徑一致性差,且菌絲擴散較多。綜合以上產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率、殘還原糖以及菌球形態(tài)考慮,4種有機氮源中,玉米漿與大豆蛋白胨發(fā)酵性能最好,但從生產(chǎn)成本問題考慮,最終選取玉米漿為檸檬酸玉米清液發(fā)酵最適有機氮源。
2.1.2 玉米漿加入量的確定
2.1.1試驗確定玉米漿為最佳有機氮源,玉米漿的濃度是關(guān)系檸檬酸是否能夠高效發(fā)酵的重要因素之一,通過測定最后的產(chǎn)酸量以及糖酸轉(zhuǎn)化率,確定玉米漿最適濃度。結(jié)果如圖3所示。
圖3 不同玉米漿含量對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.3 The influence of different corn syrup content on the production of citric acid
由圖3可知,當玉米漿濃度為0.7%時黑曲霉產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率均最高,繼續(xù)增加玉米漿產(chǎn)酸量不再增加。綜合比較產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率指標,選取0.7%玉米漿作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳有機氮源添加量。
研究表明[9],在檸檬酸發(fā)酵過程中,添加一定量的(NH4)2SO4對檸檬酸產(chǎn)量有較明顯的提高。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.7%玉米漿后加不同終濃度的(NH4)2SO4,通過測定最后的產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率,從而確定玉米液化清液發(fā)酵培養(yǎng)基中(NH4)2SO4的最適濃度,結(jié)果如圖4。
圖4 不同(NH4)2SO4含量對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.4 The influence of different(NH4)2SO4concentration on the production of citric acid
由圖4可知,發(fā)酵液中(NH4)2SO4的總濃度0.1%時,產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率均為最高。在添加其他濃度的(NH4)2SO4時,產(chǎn)酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率均不理想,所以選擇0.1%作為(NH4)2SO4的最適總濃度。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的肌醇[10],最終測定最后的產(chǎn)酸量并觀察菌絲球形態(tài)從而確定清液發(fā)酵培養(yǎng)基中肌醇的最適添加量,結(jié)果如圖5、圖6。
由圖5可知,從產(chǎn)酸量以及糖酸轉(zhuǎn)化率方面看,添加一定量的肌醇對提高產(chǎn)酸量有明顯作用,添加一定量肌醇的發(fā)酵產(chǎn)酸量均高于未添加肌醇的發(fā)酵產(chǎn)酸量,其中添加總濃度0.007%的肌醇時產(chǎn)酸量以及糖酸轉(zhuǎn)化率最高。從發(fā)酵完成后鏡檢圖6可知,未添加肌醇的菌絲球菌絲擴散,菌絲球不致密,當添加0.007%肌醇時,可明顯看出菌球纏繞的很緊密,向外伸展的菌絲較少,菌絲球形態(tài)規(guī)整,繼續(xù)增加肌醇濃度時,產(chǎn)酸量不再增加且菌絲球一致性下降,菌絲擴散較多。綜合以上因素考慮選取0.007%的肌醇為最優(yōu)濃度。
圖5 不同肌醇含量對檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence of different inositol content on the production of citric acid
圖6 添加不同濃度肌醇發(fā)酵液菌絲球形態(tài)Fig.6 The mycelium pellet morphology after adding different content of inositol
表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment
選取 MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4[11-12]多種濃度進行正交試驗,正交試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。
由表 2 可知,MgSO4、CuSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、FeSO4這6個因素的不同水平中,通過極差分析可知,影響因子的主次順序為:CaCl2>MgSO4>KCl>FeSO4>ZnSO4>CuSO4,最優(yōu)組合為 A1B1C1D1E1F3,優(yōu)化后的最優(yōu)濃度:MgSO40.1 g/L,CuSO40.8 mg/L,ZnSO40.02 g/L,CaCl22.0 g/L,KCl 0.1 g/L,F(xiàn)eSO40.34 mg/L。
在最優(yōu)濃度培養(yǎng)條件下,對優(yōu)化結(jié)果進行驗證試驗,500 mL三角瓶裝液量 50 mL,36.5℃,330 r/min進行檸檬酸發(fā)酵72 h。驗證結(jié)果產(chǎn)酸量為9.96 g/100 mL,高于正交試驗中任何一組產(chǎn)酸量,驗證了最佳組合的優(yōu)勢效應(yīng)。
續(xù)表2 正交試驗結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal experiment
表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test
2.5.1 不同初糖濃度對檸檬酸清液發(fā)酵的影響
選取不同初糖濃度玉米液化清液發(fā)酵進行發(fā)酵后,測定檸檬酸產(chǎn)量,殘還原糖及固形物含量,結(jié)果見表4。
由表4可知,當初糖濃度為18%時發(fā)酵結(jié)束時產(chǎn)酸量最高,糖酸轉(zhuǎn)化率最高,且殘還原糖濃度處于較低水平。由放罐后固形物含量可知,當初糖濃度18%以上時,固形物含量明顯升高,考慮到發(fā)酵液固形物含量對下游提取的影響,綜合以上因素,最終選取18%初糖濃度進行下一步研究。
2.5.2 種齡對檸檬酸清液發(fā)酵的影響
接種不同種齡的種子液進行發(fā)酵試驗,測定最終檸檬酸產(chǎn)量,殘還原糖并記錄相應(yīng)發(fā)酵周期,結(jié)果見表5。
表4 發(fā)酵結(jié)束檸檬酸產(chǎn)量Table 4 The production of citric acid at the end of fermentation
表5 種齡對檸檬酸發(fā)酵的影響Table 5 The effect of different inoculation time on citric acid fermentation
由表5可知,隨著種齡的增大,檸檬酸酸產(chǎn)量逐漸增大,其中菌齡27 h時產(chǎn)酸量最高,因此選擇種齡27 h為黑曲霉菌種最佳移種時間。
2.5.3 不同工藝控制對檸檬酸清液發(fā)酵的影響
不同工藝控制,使發(fā)酵過程發(fā)酵液中溶氧濃度差異較大,而溶氧濃度[13-17]對檸檬酸發(fā)酵有極大的影響。從發(fā)酵開始每隔8小時取樣,測定發(fā)酵液中檸檬酸濃度、pH值的變化情況,每隔1小時記錄溶氧。結(jié)果如圖7、圖8所示。
圖7 不同工藝發(fā)酵檸檬酸溶氧曲線Fig.7 Different process fermentation citric acid dissolved oxygen curve
圖8 不同工藝對8 h檸檬酸積累的影響Fig.8 The influence of different processes on accumulation of citric acid for 8 hours
由圖7可知,0~16 h時,大通風量溶氧優(yōu)于分段通風;16 h~64 h時,方案A溶氧高于方案B。結(jié)合圖8來看,方案B中,發(fā)酵前期溶氧過高,易引起菌體增殖過剩,導致黑曲霉過早進入檸檬酸累積期,pH值下降過快。低pH值會影響糖化酶活性,進而影響原料的利用率,使發(fā)酵液殘還原糖含量過高,故發(fā)酵后期方案B產(chǎn)酸量不如方案A。最終選取方案A三段式通風量進行下一步研究。
分段通風對檸檬酸發(fā)酵的影響見圖9。
由圖9可知,在發(fā)酵前期(0~16 h)控制通風量為300 L/h,菌體大量增殖,代謝正常,發(fā)酵液pH值為3.5,該pH值有利于保持發(fā)酵液糖化酶活力,使還原糖含量上升,發(fā)酵16 h之后黑曲霉進入快速產(chǎn)酸量期,17 h~48 h通風量調(diào)整為450 L/h,轉(zhuǎn)速450 r/min~500 r/min,此時黑曲霉菌絲球代謝更加旺盛,更多的還原糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸,此時還原糖含量開始大幅度下降,產(chǎn)酸量開始大量增加;48 h以后接近發(fā)酵結(jié)束,49 h~58 h通風量調(diào)整為:通風350 L/h,轉(zhuǎn)速300 r/min,此時還原糖處于較低水平,溶氧較高,pH值相對穩(wěn)定,可降低通風和轉(zhuǎn)速。在58 h發(fā)酵結(jié)束時,檸檬酸產(chǎn)量為18.33 g/100 mL,糖酸轉(zhuǎn)化率為101.8%,殘還原糖量為0.5%。而相同發(fā)酵工藝玉米帶渣發(fā)酵液發(fā)酵水平17.5 g/100 mL,轉(zhuǎn)化率99.5%,此清液發(fā)酵水平已高于帶渣發(fā)酵產(chǎn)量水平。
圖9 分段通風對檸檬酸發(fā)酵的影響Fig.9 The effect of segmented ventilation on citric acid fermentation
本研究對玉米液化清液發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,通過對氮源,營養(yǎng)因子,金屬離子的多次單因素試驗及正交試驗,最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:玉米清液糖濃度為18%,玉米漿0.7%,(NH4)2SO41.0 g/L,MgSO40.1 g/L,CuSO40.8 mg/L,ZnSO40.02 g/L,CaCl22.0 g/L,KCl 0.1 g/L,F(xiàn)eSO40.34 mg/L,肌醇0.007%。在種齡27h,分段通風轉(zhuǎn)速控制的發(fā)酵條件下,發(fā)酵周期為60 h,檸檬酸產(chǎn)量達到18.33 g/100 mL,糖酸轉(zhuǎn)化率為101.8%,殘還原糖量為0.5%,而相同發(fā)酵工藝玉米帶渣發(fā)酵液發(fā)酵水平17.5 g/100 mL,轉(zhuǎn)化率99.5%,由此,玉米清液發(fā)酵有望成為檸檬酸新型發(fā)酵方式。