龍艷珍，吳菲菲，2，李化強，2，*，趙良忠，2

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽422000；2.湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)研究中心，湖南邵陽422000）

酶法加工已遍布各行各業(yè)，而在果蔬加工中主要應(yīng)用到的許多重要酶制劑，如果膠酶、纖維素酶等都依賴進口，進口意味著果蔬加工生產(chǎn)成本高，行業(yè)發(fā)展受到嚴重限制，而棘孢木霉（Trichoderma asperelham）發(fā)酵可產(chǎn)生一系列對細胞壁具有水解作用的水解酶，如纖維素酶、果膠酯酶、果膠裂解酶等[1]，另外，棘孢木霉菌株還可應(yīng)用于生物防治方面[2-4]，且效果良好。在團隊前期的研究中發(fā)現(xiàn)，所篩選出的棘孢木霉菌株發(fā)酵液[5]具有降解柑橘白皮層和囊衣的作用且降解效果較好，這與前人對棘孢木霉菌株產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶、幾丁質(zhì)酶、果膠酶等[6-9]的研究一致。另外，在將棘孢木霉應(yīng)用到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的過程中發(fā)現(xiàn)，菌株的貯藏、活化、制備及運輸，都存在諸多問題，如活化時間長、貯藏條件要求高、需要冷鏈運輸?shù)惹闆r。綜上，采用真空冷凍干燥技術(shù)對菌株進行凍干處理，以便保藏及應(yīng)用。

常見且易于實現(xiàn)的菌種保藏法為甘油法[10-11]，其操作相對比較簡單，適用范圍廣[12]，但需要低溫冰箱常年冷凍且菌種的保藏期限不確定。真空冷凍干燥技術(shù)是既能完成凍干任務(wù)又能很好的保護目標物活性的一種技術(shù)[13]。在九十多年的研究中，真空冷凍干燥技術(shù)的應(yīng)用潛力被大量的開發(fā)，其中有人用于研究菌種的保藏[14-17]、食品原料的干制[18-19]、活性成分的干制[20-22]等方面，取得了良好的效果。與其他方法相比，真空冷凍干燥技術(shù)處理菌株存活率較高，菌株活性保持較好，遺傳特性較為穩(wěn)定，復水再生性良好、便于長期儲存和不易變質(zhì)等[23-24]。近些年，前人將真空冷凍干燥技術(shù)用于保藏霉菌菌種如白地霉[25]、黑曲霉[15]、棒曲霉[14]等，但關(guān)于棘孢木霉真空冷凍干燥的研究鮮有報道。

本文主要是通過真空冷凍干燥技術(shù)將棘孢木霉菌液有效的轉(zhuǎn)化成相對穩(wěn)定、易于運輸?shù)募吣久咕?，此狀態(tài)下的菌種輕便、干燥，在運輸、應(yīng)用及保藏方面相當便捷。另外，通過將凍干后的菌粉進行復蘇發(fā)酵培養(yǎng)，探究凍干處理對棘孢木霉發(fā)酵穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉菌Trichoderma asperelham（中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏號為CGMCC No：14636）作為本試驗的目的菌株，由湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)中心從湖南邵陽柑桔園中采樣獲得，再從以桔皮粉為主要成分的選擇性培養(yǎng)基[26]中分離得出。挑選品質(zhì)相同、大小相似的市售湘西椪柑為供試果實。

脫脂牛奶：莫萊高博恩共營有限公司；Evans blue：生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司；銀湖SP-780加氧泵：中山市日勝電器制品有限公司；DW-FL450A1超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；BA310 Digital顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；SW-CJ-1D凈化工作臺：蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；IS-RDD3恒溫振蕩培養(yǎng)箱：美國精騏儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 制備凍干菌粉的工藝流程

取-40℃40%甘油管保藏的棘孢木霉菌，溶解，在無菌條件下接入液體培養(yǎng)基[26]中，在30℃、160 r/min下培養(yǎng)48 h，活化培養(yǎng)兩次，然后用接種環(huán)將棘孢木霉菌接種于斜面培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃培養(yǎng)6 d，備用。挑取斜面培養(yǎng)基中的棘孢木霉劃入空白平板中，30℃下培養(yǎng)6 d，然后，在無菌工作臺中，以5 mL無菌水將成熟的孢子洗出，裝入10 mL無菌螺口試管中，制取得孢子懸液，根據(jù)血球計數(shù)板法測定孢子的數(shù)量，用以確定孢子濃度，按要求調(diào)配脫脂牛奶的添加量，然后在-40℃冰箱中進行預凍，再進行真空冷凍干燥，收集干粉，制備得發(fā)酵劑。

1.2.2 菌液濃度測定

選用血球計數(shù)板法對菌懸液進行計數(shù)，即將菌懸浮液放在血球計數(shù)板與蓋片之間的計數(shù)室中，使用計數(shù)板25×16規(guī)格進行計數(shù)，每個樣品重復計數(shù)3次，取其平均值。公式如下：

1.2.3 菌種存活率測定

采用伊文思藍作為活菌計數(shù)的染色劑[27]，伊文思藍作為一種活性染料，可對死細胞進行著色，而未失活的細胞由于排異的作用而出現(xiàn)透明的情況，從而實現(xiàn)活菌計數(shù)。通過血球計數(shù)板法進行計數(shù)，計算得活菌數(shù)。菌種凍干存活率的計算：W/%=n2/n1×100式中：n1為未進行冷凍干燥前活菌數(shù)，個/mL；n2為凍干菌粉復水至凍干前體積活菌數(shù)，個/mL。

1.2.4 發(fā)酵液制備

凍干結(jié)束后，將菌粉以凍干前相同體積的無菌水在無菌條件下復溶，取出5 mL計數(shù)用，取1 mL 1×107個/mL加入到裝有500 mL桔皮粉液體培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶中，在30℃、160 r/min條件下，培養(yǎng)時間 72 h，離心取上清液（4℃，10 min，3 800 r/min），備用。

1.2.5 發(fā)酵液降解試驗

采用8瓣/200mL（500mL塑料燒杯），功率為5W、氣壓為0.025MPa的加氧泵進行鼓泡，降解溫度為50℃，待其達到70%降解效果后，取出，記錄降解所需時間。

1.2.6 發(fā)酵液降解效果評價指標

參考李杰等[28]對柑橘橘皮及囊衣降解效果的評價標準并做相應(yīng)修改，感官評價標準如下：

表1 感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Ponkan segments

1.2.7 單因素試驗

1.2.7.1 保護劑添加量的確定

在菌液濃度為1×108個/mL，預凍時間為12 h的情況下，選定凍干保護劑添加量分別為14、16、18、20、22%5個水平進行真空冷凍干燥，每個水平3組平行，以存活率、橘瓣降解時間為指標，獲得最佳的保護劑添加量。

1.2.7.2 菌液濃度的確定

在保護劑添加量為20%，預凍時間為12 h的情況下，將菌液的濃度分別調(diào)配成 1×106、1×107、1×108、1×109個/mL 4個水平進行凍干處理，每個水平3組平行，以存活率、降解時間為指標確定最佳菌液濃度。

1.2.7.3 預凍時間的確定

在保護劑添加量為20%、菌液濃度為1×108個/mL的情況下，選定預凍時間為12、18、24、30 h 4個水平進行真空冷凍干燥處理，每個水平3組平行，以存活率、降解時間為指標確定最佳真空冷凍干燥預凍時間。

1.2.8 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行三因素三水平的正交試驗優(yōu)化，確定最佳真空冷凍干燥工藝條件，因素水平表見表2。

表2 正交試驗水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以均值±標準差（mean±SD）表示，每個處理重復3次，采用Eexcel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 保護劑添加量

保護劑添加量與存活率及橘瓣降解時間的關(guān)系見圖1。

圖1 保護劑添加量與存活率及橘瓣降解時間的關(guān)系Fig.1 The relationship between content of cryoprotectant and servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖1可知，保護劑添加量從14%到20%之間，菌株的存活率上升速度最快，降解時間也逐漸變短，而20%之后菌株的存活率增長緩慢，降解時間逐漸趨于穩(wěn)定。綜上，選擇凍干保護劑添加量為20%進行后續(xù)的試驗。

2.1.2 菌液濃度

菌液濃度與存活率及橘瓣降解時間的關(guān)系見圖2。

圖2 菌液濃度與存活率及橘瓣降解時間的關(guān)系Fig.2 The relationship between the concentration of bacterial solution and servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖2可知，菌液濃度從1×106個/mL到1×108個/mL之間，菌株的存活率呈急劇上升的趨勢，降解時間逐漸變短，在1×108個/mL時，存活率達到最大值，降解時間達到最小值，而1×108個/mL之后菌株的存活率下降，降解時間加長。綜上，選擇菌液濃度為1×108個/mL進行后續(xù)的試驗。

2.1.3 預凍時間

預凍時間與存活率及橘瓣降解時間的關(guān)系見圖3。

圖3 預凍時間與存活率及橘瓣降解時間的關(guān)系Fig.3 The relationship between pre-freezing time andand servival rate and the degradation time of Ponkan segments

由圖3可知，預凍時間在24 h時，存活率達到最大值，降解時間達到最小值，而少于或超過24 h菌株的存活率下降，降解時間延長?？赡艿脑蚴穷A凍時間太長導致菌株死亡或失去活性，而預凍時間短物料未能預凍完全，在抽真空的過程中發(fā)生飛灑而導致其損失。綜上，選擇最佳預凍時間為24 h。

2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表3。

表3 正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Table 3 Experimental design and result of orthogonal experiments

根據(jù)極差Rs、Rd可判斷出各因素對真空冷凍干燥工藝的影響為：B＞A＞C（菌液濃度＞保護劑添加量＞預凍時間）。從表3中我們看出，棘孢木霉的最佳凍干工藝為A2B2C2，即菌液濃度為1×108個/mL，脫脂牛奶保護劑添加量為20%，預凍時間為24 h。

2.3 驗證試驗

在最佳條件下，即菌液濃度為1×108個/mL，脫脂牛奶保護劑添加量為20%，預凍時間為24 h，進行真空冷凍干燥處理，重復3次，菌株的存活率達到81.25%，橘瓣的降解時間為31 min，由此可見，經(jīng)過真空冷凍干燥處理后，棘孢木霉活性保持良好。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，確定棘孢木霉菌株的最佳真空冷凍干燥工藝參數(shù)為：保護劑添加量為20%，預凍時間為 24 h，菌液濃度為 1×108個/mL，在最優(yōu)條件下，菌株的存活率達到81.25%，橘瓣降解所需時間為31 min為木霉菌的真空冷凍干燥提供參考依據(jù)，也為菌株保藏和運輸帶來了便捷。