秦沖，施暢，萬秋月，王磊，劉愛琴，安彩秀

（河北省地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測試中心，河北保定071051）

硒是人體必需的微量元素之一，是組成谷胱甘肽過氧化酶的重要成分，具有延緩衰老、抗癌防癌、提高免疫力、拮抗重金屬毒性、清除人體內(nèi)有害自由基等功能[1-5]。同時(shí)硒是典型的雙功能元素之一，其生理需求量范圍比較窄，日攝入量過低，會(huì)導(dǎo)致硒缺乏癥；日攝入量過高又會(huì)導(dǎo)致硒中毒[6-9]。硒的生物有效性以及毒性不僅取決于硒的總量，而且與硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[10-11]，例如亞硒酸鹽的毒性大于硒酸鹽，硒化氫的毒性最大，而硒代氨基酸等有機(jī)硒的生物利用率較高[12]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；PRP X-100分析柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）、PRP X-100保護(hù)柱（20 mm×2.1 mm，10 μm）：瑞士 Hamilton公司；MARS微波消解系統(tǒng)：美國CEM公司。

硒酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW10033）、亞硒酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW10032）：中國計(jì)量科學(xué)研究院；硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸（純度98%）、蛋白酶K、蛋白酶XIV：百靈威公司；富硒小麥：京津冀地區(qū)。

1.2 儀器工作條件

儀器工作條件見表1。

表1 HPLC及ICP-MS的主要工作參數(shù)Table 1 Main operation parameters for the HPLC and ICP-MS

1.3 樣品前處理

富硒小麥樣品采集自京津冀地區(qū)，洗凈凍干后粉碎，過100目篩，將樣品置于4℃冰箱中避光保存。

1.3.1 微波萃取測定硒形態(tài)

稱取0.500 0 g上述樣品于消解罐中，加入15 mg蛋白酶XIV和10 mL超純水進(jìn)行微波萃取。采用如下萃取程序：200 W，10 min升溫到37℃，控溫37℃萃取 30 min。萃取液經(jīng)離心（6 000 r/min，5 min）后，過0.45 μm水性濾膜，進(jìn)行硒形態(tài)分析。同樣方法做試劑空白試驗(yàn)。

1.3.2 微波消解測定總硒

稱取0.200 0 g上述樣品于消解罐中，加入5 mL HNO3和3 mL H2O2進(jìn)行微波消解。采用如下萃取程序：800 W，10 min升溫到190℃，控溫190℃消解30 min。消解結(jié)束后，冷卻，打開消解罐，樣品溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水洗滌3次，合并洗滌液，再用超純水定容，搖勻。直接用ICP-MS測定硒總量。同樣方法做試劑空白試驗(yàn)。

陶水旺就是被那個(gè)畜生蹬到水里的人。怪不得，那天晚上的木排老是晃晃悠悠的，他一直沒離開啊。表姐腦子一下子空了，碗落在鍋里，咚的一聲，摔成了兩瓣。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

在硒的形態(tài)分析中，彭嵐等[16]用5 mmol/L四丁基硫酸氫銨-2.5 mmol/L磷酸二氫銨-5%甲醇作為流動(dòng)相分離測定了底泥中的4種硒形態(tài)。Hsieh等[13]用2 mmol/L 1-戊磺酸鈉-5 mmol/L檸檬酸-3%甲醇和5 mmol/L磷酸二氫鈉-5 mmol/L檸檬酸-3%甲醇作為流動(dòng)相分離測定了大米中5種硒形態(tài)。經(jīng)試驗(yàn)研究，使用檸檬酸作為流動(dòng)相，成分單一、無毒、配制簡單，在9 min內(nèi)可完全分離4種不同硒形態(tài)，因此本試驗(yàn)選用檸檬酸作為流動(dòng)相。

2.2 流動(dòng)相濃度的影響

在檸檬酸濃度為2 mmol/L～10 mmol/L范圍內(nèi)，用20%的氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH=5.0，考察了檸檬酸濃度對4種硒形態(tài)保留時(shí)間的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 檸檬酸濃度對4種硒形態(tài)保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of concentration of citric acid on the retention time of four selenium species

隨著流動(dòng)相濃度升高，SeVI的保留時(shí)間迅速減少，當(dāng)濃度達(dá)到10 mmol/L，SeMet和SeVI的保留時(shí)間接近，分離效果較差。當(dāng)流動(dòng)相濃度為6 mmol/L時(shí)，各硒形態(tài)可在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的分離，因此本試驗(yàn)選擇流動(dòng)相濃度為6 mmol/L。

2.3 流動(dòng)相酸度的影響

在不同的酸度條件下，硒的不同形態(tài)會(huì)以陽離子、陰離子或者兩性離子的形式存在[17]，因此流動(dòng)相pH變化對各硒形態(tài)的分離效果和保留時(shí)間影響很大。流動(dòng)相濃度為6 mmol/L時(shí)，分別用20%的氨水調(diào)節(jié)檸檬酸溶液的pH，在pH為4.0～6.0范圍內(nèi)，考察了檸檬酸酸度對4種硒形態(tài)保留時(shí)間的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 流動(dòng)相酸度對4種硒形態(tài)保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of the pH of citric acid on the retention time of four selenium species

隨著pH增大，SeVI的保留時(shí)間急劇減少，當(dāng)pH=5.0時(shí)，4種硒形態(tài)分離效果令人滿意，本試驗(yàn)選擇流動(dòng)相的pH為5.0。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

使用本文建立的方法進(jìn)行檢測，SeIV和SeVI的線性范圍為 0.5 μg/L～500 μg/L，SeMet和 SeCys2的線性范圍為 1.0 μg/L～600 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999，以 3 倍信噪比計(jì)算檢出限，SeCys2、SeIV、SeMet、SeVI的檢出限分別為 0.23、0.15、0.30、0.16 μg/L。4 種硒形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2，4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖3。

表2 4種硒形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linearranges，linearequations，correlationcoefficients（r2）and limits of detection（LOD）for the four selenium species

2.5 硒形態(tài)提取方法

以SeMet和SeCys2陽性小麥樣品探討了超純水提取、稀酸提取、酶水解提取的效果，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

圖3 4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of a standard solution of the four selenium species

表3 使用不同提取劑得到的富硒小麥中硒形態(tài)分析結(jié)果Table 3 Analytical results of selenium species using different agents in selenium-enriched wheat

超純水和0.1 mol/L HCl溶液都無法將SeMet和SeCys2從富硒小麥中有效提取出來，蛋白酶K和蛋白酶XIV都可水解提取SeMet和SeCys2，其中蛋白酶XIV水解效果更好。因此，本試驗(yàn)選擇使用蛋白酶XIV水解提取作為富硒小麥中硒形態(tài)的提取方法。

2.6 提取條件優(yōu)化

以小麥為例考察蛋白酶XIV的加入量及酶水解時(shí)間對SeMet和SeCys2提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稱樣量為0.500 0 g時(shí)，提取液中SeMet和SeCys2含量隨酶加入量增大而提高，酶加入量為15 mg時(shí)，SeMet和SeCys2含量達(dá)到最大值；蛋白酶XIV在37℃（蛋白酶XIV的最佳水解溫度）提取30 min后SeMet和SeCys2含量達(dá)到最大值。因此，選擇使用15 mg蛋白酶XIV在37℃提取30 min作為酶水解提取的最佳條件。

利用微波輔助酶萃取需時(shí)30 min，而文獻(xiàn)報(bào)道恒溫水浴搖床上振蕩提取硒形態(tài)的時(shí)間為7 h[4]，超聲波輔助酶提取硒形態(tài)的時(shí)間為1.5 h[18]，因此本方法大大縮短了提取時(shí)間。

2.7 方法的回收率與精密度

采用本方法測定富硒小麥中硒形態(tài)，色譜圖見圖4。

對樣品中4種硒形態(tài)進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，分析結(jié)果如表4所示。

圖4 富硒小麥色譜圖Fig.4 Chromatogram of a selenium-enriched wheat

表4 4種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 4 Spiked recoveries and precisions for four selenium species（n=6）

得到回收率在93.7%～105.2%之間，回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在2.2%～6.6%之間，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7 實(shí)際樣品分析

將本文建立方法用于測定5個(gè)富硒小麥中硒形態(tài)，同時(shí)利用微波消解測定總硒含量，分析結(jié)果匯總?cè)绫?所示。

表5 富硒小麥分析結(jié)果Table 5 Analytical results of selenium-enriched wheat

富硒小麥中主要含有SeMet和SeCys22種硒形態(tài)，說明富硒小麥中的硒大多以硒代蛋白的形式存在。4種硒形態(tài)總量在0.203 mg/kg～0.378 mg/kg之間，富硒小麥中總硒量在0.214 mg/kg～0.396 mg/kg之間，提取率在94.86%～97.42%之間，說明樣品中硒形態(tài)基本提取完全。

3 結(jié)論

利用微波輔助酶萃取進(jìn)行樣品前處理，建立了HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)測定富硒小麥中SeIV、SeVI、SeMet和SeCys24種常見硒形態(tài)的分析方法。該方法萃取時(shí)間短、操作簡單、精密度和準(zhǔn)確度良好，為富硒小麥中硒形態(tài)分析提供了切實(shí)可行的方法，在富硒食品中硒形態(tài)分析領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。