屠夢婷,陳琦,朱婉姣,孫辰茹,金清馨,張有做,許光治
(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室,浙江臨安311300)
楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)是我國南方特色水果,它屬楊梅科喬木植物,果實香氣怡人,呈棕褐色、紫黑色,酸甜適口而廣受歡迎[1]。楊梅果肉中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)元素、膠、纖維素、蛋白質(zhì)及人體所需的8種必需氨基酸;其鐵、磷、鈣的含量也非常高,約為其它水果含量的十倍以上而且具有食用、藥用雙重價值。由于楊梅果實成熟于高溫多雨的季節(jié),且其果實柔軟多汁,無外果皮包裹,采后呼吸旺盛,因而不耐儲運[2],導(dǎo)致大量積壓、腐爛。目前,楊梅的深加工產(chǎn)品多見于糖水罐頭、蜜餞、果汁、飲料、果醋等產(chǎn)品[3-4]。
利用新鮮楊梅發(fā)酵的果酒,不僅保留楊梅本身的營養(yǎng)物質(zhì),而且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的高級醇、酯、揮發(fā)性酸等物質(zhì)賦予了果酒新的風(fēng)味。杜晶等[5]對從楊梅樹葉、果園土壤及楊梅自然發(fā)酵繆中分離篩選出適宜楊梅果酒發(fā)酵的釀造酵母及產(chǎn)香酵母進行菌種鑒定和耐受性研究。李潔瑩等[6]對無醇楊梅果酒的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,得出最適宜的發(fā)酵條件,并將無醇楊梅果酒與楊梅汁香氣成分進行對比分析。徐安書等[7]對以葡萄酒活性干酵母為菌種制備楊梅果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)進行了考察。
果酒釀造中,酵母對果酒品質(zhì)有重要影響。因此,釀酒的過程中選擇一種合適的酵母不僅能提高果酒的口感和風(fēng)味[8],還可以提升果酒的品質(zhì)[9]。楊梅果酒的發(fā)酵研究還主要集中于發(fā)酵酵母的篩選和工藝優(yōu)化,關(guān)于不同酵母對楊梅果酒品質(zhì)的影響還研究的較少。目前D254酵母和71B酵母在果酒釀造中運用較廣,這兩種果酒酵母產(chǎn)酒精能力強,酸度較低[10-11]。71B酵母在蓮霧果酒的釀制中發(fā)酵速率快,具有較強的降酸功能,且色香味最佳,可作為蓮霧果酒工廠化生產(chǎn)的酵母[12]。在干紅櫻桃酒釀制過程中,7株商業(yè)釀酒酵母只有酵母D254發(fā)酵效率高,且賦予果酒較佳的感官品質(zhì)[13]。
本研究分析D254和71B這兩種酵母對楊梅果酒發(fā)酵及風(fēng)味的影響,以期為楊梅果酒的進一步開發(fā)及工藝優(yōu)化提供參考。
楊梅:采于仙居?xùn)|魁;酵母D254和酵母71B:上海瑞楚生物科技有限公司;無水碳酸鈉、無水亞硫酸鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、乙酸鈉、氯化鉀、鹽酸(均為分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
HR-3001B攪拌器:佛山艾詩凱奇電器有限公司;D-37520離心機:美國Sigma-Aldrich;pH-10酸度計:浙江力辰儀器科技有限公司;HWS-150恒溫恒濕箱:上海精宏實驗儀器設(shè)備有限公司;GCMS-QP210PLUS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、UV-1800紫外分光光度計:日本島津公司。
1.3.1 楊梅果酒的制作工藝及流程
楊梅果酒的制作工藝及流程主要參考侍崇娟等[14]方法并略作改動,如下:
楊梅汁處理:取冷凍楊梅解凍,經(jīng)挑選去除霉變果后清洗,去核榨汁后離心(16 873×g)15 min,分別用0.65 μm和0.45 μm膜過濾,取過濾后楊梅汁30 mL,添加蔗糖至楊梅汁可溶性固形物濃度達到20%,用蘋果酸調(diào)節(jié)pH值至3.5。
將酵母按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的接種量加至楊梅汁中進行主發(fā)酵。在25℃條件下發(fā)酵35 d,發(fā)酵過程中比較 0、2、4、7、14、21、35 d 這 7 個時間段中不同菌種發(fā)酵酒的酵母菌數(shù)量、總酸含量、還原糖含量、可溶性固形物含量以及花青素含量。發(fā)酵結(jié)束后對楊梅果酒取樣進行香氣成分分析。
1.3.2 楊梅果酒理化指標(biāo)測定
總酸含量測定:參照Wojdylo A等[15]方法測定。可溶性固形物含量測定:采用3,5-二硝基水楊酸比色法[16]測定。酵母細胞數(shù)量測定:采用平板計數(shù)法測定?;ㄇ嗨睾繙y定:參照孫曉偉等[17]方法測定。理化指標(biāo)重復(fù)測定3次。
1.3.3 楊梅果酒揮發(fā)性香氣成分測定
采用頂空固相萃取法(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)對楊梅果酒中的香氣物質(zhì)進行提現(xiàn)。取3 mL主發(fā)酵結(jié)束后的酒樣至10 mL頂空瓶中,密封好后將經(jīng)老化的萃取針插入樣品頂空處,置50℃水浴中,待放穩(wěn)后推出萃取針頭,頂空萃取30 min后將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)進樣口,解吸3 min。
參照馬騰臻等[18]方法并略作修改。
GC-MS條件:
色譜條件:RTX-5MS色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 mm);進樣口溫度250℃;升溫程序:色譜柱初溫40℃保持5 min,以6℃/min升至120℃,保持5 min后以5℃/min升至250℃,保持15 min;載氣:高純He;流速:3 mL/min;不分流進樣。
質(zhì)譜條件:電子電離源;離子源溫度230℃,接口溫度250℃,質(zhì)量掃描范圍40 m/z~500 m/z。
主要采用Excel2007、SPSS19.0等進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理。
酵母在發(fā)酵過程中數(shù)量變化見圖1。
圖1 兩種酵母釀造楊梅果酒酵母數(shù)量(濃度)隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Changes of yeast number(concentration)in fermented waxberry wine with different fermentation time by two kinds of yeast
酵母在發(fā)酵過程中數(shù)量變化如圖1所示,酵母71B的數(shù)量在第2天快速增加至第7天達到最高值為1.43×108個/mL后有個緩慢減少的過程,最后基本達到平臺期;而酵母D254在第2天快速增加至第7天后仍緩慢上升至第15天達到最高值為1.30×108個/mL但仍不及71B,到第15天之后,酵母D254生長基本至停滯狀態(tài),微生物數(shù)量變化很小。
在發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化見圖2。
圖2 兩種酵母釀造楊梅果酒理化指標(biāo)的變化Fig.2 Changes of physical and chemical indexes in fermented waxberry wine with different fermentation time by two kinds of yeast
由圖2可知,隨著發(fā)酵時間的增長,總酸含量呈先上升至最大值后稍微下降至穩(wěn)定趨勢,還原糖含量、可溶性固形物含量和花青素含量均呈先下降后穩(wěn)定的趨勢,pH值控制在3.3~3.5且無明顯變化,酵母菌比細菌耐酸,低pH值能抑制雜菌的生長,低pH值和高含量的有機酸有助于穩(wěn)定顏色和口感[19],提高楊梅果酒的質(zhì)量??偹岫仍跅蠲饭漆勗熘惺且粋€重要的理化指標(biāo),它直接影響楊梅的顏色、口感和風(fēng)味。酵母D254在楊梅果酒的發(fā)酵過程中總酸度迅速上升至第4天達到最大值為10.91g/L,隨后下降至平臺期。酵母71B在楊梅果酒的發(fā)酵過程中總酸度迅速上升到第4天后持續(xù)緩慢上升至第14天達到最大值為10.77 g/L,隨后緩慢下降至平臺期。與酵母D254相比,發(fā)酵結(jié)束后71B制得的果酒總酸含量明顯高于酵母D254。另外,兩種酵母在發(fā)酵釀制楊梅果酒過程中的可溶性固形物含量均持續(xù)下降至第14天后呈穩(wěn)定趨勢,整體變化趨勢相似且基本無差異,相對而言71B含量較高。兩種酵母在發(fā)酵釀制楊梅果酒過程中還原糖含量有明顯的降低過程,整體變化趨勢與可溶性固形物含量變化趨勢相似且基本無差異。整個發(fā)酵過程中,楊梅果酒中的花青素(矢車菊花素-3-葡萄糖苷)含量呈遞減趨勢。原汁中花青素的含量為(0.501±0.013)g/L,酵母D254在楊梅果酒的發(fā)酵過程中花青素含量在前14天持續(xù)下降,第14天后花青素含量顯著減少(P<0.05),在第21天趨于穩(wěn)定。酵母71B在楊梅果酒的發(fā)酵過程中花青素含量在前7天顯著減少(P<0.05)后持續(xù)緩慢下降,在第21天趨于穩(wěn)定。釀酒過程結(jié)束時,由D254酵母發(fā)酵的楊梅果酒花青素含量為(0.201±0.009 7)g/L;由71B酵母發(fā)酵的楊梅果酒花青素含量為(0.231±0.016)g/L。
發(fā)酵結(jié)束后不同接種發(fā)酵果酒中香氣成分見圖3和圖4。
圖3 果酒酵母D254發(fā)酵楊梅果酒香氣成分GC/MS圖譜Fig.3 Total ion current chromatogram of the aromatic components in waxberry wine fermented with yeast D254
圖4 酵母71B發(fā)酵楊梅果酒香氣成分GC/MS圖譜Fig.4 Total ion current chromatogram of the aromatic components in bayberry wine fermented with wine yeast 71B
果酒的香氣成分是水果(品種香氣)、果酒發(fā)酵過程形成的次級代謝產(chǎn)物(發(fā)酵香味)和陳釀階段形成的揮發(fā)性化合物的獨特混合[20]。由于特定的酵母菌株可能有助于楊梅果酒的特征風(fēng)味,并且還可以在發(fā)酵期間產(chǎn)生不同量的芳族化合物[21],而這些芳香活性化合物的產(chǎn)生在不同酵母菌株之間存在高度的差異,因此,精心挑選具有最佳芳香族特征的菌株對于高質(zhì)量的最終產(chǎn)品而言是至關(guān)重要的[22]。對2個圖中任一峰面積相對強度不低于0.8%的共28種成分進行了分析,其中檢測到D254發(fā)酵楊梅果酒22種香氣成分、71B發(fā)酵楊梅果酒24種。兩批楊梅果酒香氣成分的比較分析及統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。
表1 2種酵母發(fā)酵的楊梅果酒主要香氣成分Table 1 Aroma components in waxberry wines fermented with two yeasts
通過GC-MS初步鑒定兩種酵母發(fā)酵的楊梅果酒酒樣中的28種香氣成分(見表1),這些成分主要是醇類3種、酸類2種、酯類15種、醛酮類2種、烷烴、烯烴類3種、酚醚類1種以及其他類2種。
在酵母D254釀造的楊梅果酒中,共檢測出22種香氣成分,占總峰面積的97.17%。其中,醇類71.64%、酸類9.02%、酯類10.34%、醛酮類0.32%以及烷烴、烯烴類0.23%。其主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇、乙酸、甲氧基苯基肟和十六酸乙酯,相對含量分別為70.77%、7.96%、4.29%和3.43%。
在酵母71B釀造的楊梅果酒中,共檢測出24種香氣成分,占總峰面積的98.19%。其中,醇類72.49%、酸類4.05%、酯類16.22%以及烷烴、烯烴類1.11%。其主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、十六酸乙酯、甲氧基苯基肟和2,3-丁二醇,相對含量分別為62.71%、6.61%、5.22%、4.02%和3.17%。
續(xù)表1 2種酵母發(fā)酵的楊梅果酒主要香氣成分Continue table 1 Aroma components in waxberry wines fermented with two yeasts
兩種楊梅果酒中香氣成分類型及相對含量見圖5。
圖5 兩種酵母發(fā)酵的楊梅果酒香氣成分類型及相對含量Fig.5 Chemical classes and contents of aroma components in waxberry wine fermented with two yeasts
楊梅果酒中香氣成分按化合物結(jié)構(gòu)分為醇類,酸類,酯類,醛、酮類,烷烴,烯烴類,酚、醚類和其他類,各類香氣物質(zhì)的相對含量由圖5可知,楊梅果酒香氣成分中主要以醇類和酯類為主(占80%多)且與以往研究結(jié)果類似,說明了在楊梅果酒的釀制中醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)是主要的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。兩種楊梅果酒中,酯類和酸類物質(zhì)的相對含量差別較明顯,尤其是酵母71B發(fā)酵的楊梅果酒中酯類物質(zhì)的相對含量相比酵母D254發(fā)酵的楊梅果酒高5.88%,這是因為果酒的成分極其豐富,發(fā)酵原料、酵母菌種以及發(fā)酵工藝操作和發(fā)酵條件等各項因素均會影響成品果酒的香氣成分組成[23]。而醇類、醛酮類、烷烯類、醚類以及其他類物質(zhì)的相對含量差異較小。
2.4.1 醇類香氣物質(zhì)比較
由圖5可知,醇類物質(zhì)是果酒中主要的呈香物質(zhì)。高級醇的總量與3-甲基-1-丁醇的濃度密切相關(guān),3-甲基-1-丁醇的濃度高于每種形式的總醇的60%以上[24]。由表1可知,兩種楊梅果酒中共檢測出3種醇類物質(zhì),相同醇類有2種,其中由酵母D254釀制的楊梅果酒中含量較高的只有3-甲基-1-丁醇,而酵母71B釀制的楊梅果酒中含量較高的醇類組分是3-甲基-1-丁醇和苯乙醇,3-甲基-1-丁醇是含量最多的高級醇類物質(zhì),是楊梅果酒重要的特征風(fēng)味化合物。酵母71B釀制的果酒中含有的苯乙醇具有玫瑰花香[25]且從圖5可以看出,酵母71B發(fā)酵的楊梅果酒中醇類物質(zhì)的含量最高,這就說明酵母71B總體產(chǎn)醇能力要優(yōu)于酵母D254。
2.4.2 酸類香氣物質(zhì)比較
由表1可知,酵母D254和酵母71B發(fā)酵的楊梅果酒中均檢測出2種酸類分別是乙酸和辛酸,相對含量分別為7.96%,2.87%和1.06%,1.18%。兩種酵母釀制的楊梅果酒酸類物質(zhì)含量相比較明顯,如酵母D254釀制的果酒中乙酸的相對含量達到7.96%。
2.4.3 酯類香氣物質(zhì)比較
由圖5可知,兩種楊梅果酒中共檢測出酯類物質(zhì)15種,其中11種酯類物質(zhì)是兩種共有的。由表1可知,酵母71B發(fā)酵的楊梅果酒種酯類組分的相對含量最高達到16.22%,說明酵母71B總體產(chǎn)酯能力要優(yōu)于酵母D254。相對含量較高的幾種酯類物質(zhì)如十六酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、辛酸乙酯和十八酸乙酯為兩種果酒所共有,但相對含量差異較大,尤其是酵母71B發(fā)酵果酒中十六酸乙酯和癸酸乙酯的相對含量遠高于酵母D254。酯類香氣主要是酵母菌活動以及在漫長的陳釀過程中產(chǎn)生,大多數(shù)都具有明顯的花香味,如十六酸乙酯呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣;癸酸乙酯具有葡萄的香氣[26];辛酸乙酯具有白蘭地酒香味等。
2.4.4 醛、酮類香氣物質(zhì)比較
由表1可知只有酵母D254檢測出醛、酮類物質(zhì)2種,而71B未檢測到,這可能是受菌株本身的限制,如在發(fā)酵過程中不能產(chǎn)生這種成分,也可能是受檢測方法的限制。雖然果酒釀制中醛、酮類物質(zhì)的存在會對果酒香氣有一定的貢獻,如癸醛存在于柑橘、檸檬、草莓等中,具有甜香、柑橘香、蠟香和花香,但其中D254含有少量的2,5-二(三甲硅氧基)苯甲醛對人體有害的成分,而酵母71B不含有對人體有害的成分。
2.4.5 其他類香氣物質(zhì)比較
兩種酵母發(fā)酵的楊梅果酒中檢測出3種烷烴、烯烴類物質(zhì),1種酚、醚類,3種其他類物質(zhì),其中兩種果酒共有的烷烴、烯烴類物質(zhì)只有一種石竹烯(見表1)。有對東魁等品種楊梅的特征香氣成分的研究表明,石竹烯等半萜烯類成分是楊梅的主要芳香物質(zhì)[27],然而由發(fā)酵制備的楊梅果酒、果醋中石竹烯含量卻很低[28],本文的結(jié)果也是如此,含量較低可能是由于發(fā)酵前的加熱滅菌、酵母代謝及發(fā)酵散逸造成[28]。由表1結(jié)果可知,71B楊梅果酒石竹烯含量最高為0.31%,即酵母71B發(fā)酵制備楊梅果酒中含有的石竹烯等半萜烯類成分的損失相對小。在酵母D254和酵母71B發(fā)酵的楊梅果酒中均檢測出甲氧基苯基肟,且相對含量較高,相對含量分別達到4.29%和4.02%,說明甲氧基苯基肟為楊梅果酒中主要風(fēng)味物質(zhì)之一。
本文對D254和71B這兩種酵母菌進行發(fā)酵試驗制備楊梅果酒。測定指標(biāo)的變化趨勢表明,71B酵母釀酒過程中,生長狀況佳。采用GC-MS分析兩種酵母發(fā)酵的楊梅果酒香氣成分,兩種酵母發(fā)酵的酒樣中共檢測出香氣28種,其中在酵母D254發(fā)酵的楊梅果酒中共檢測出香氣成分22種,在酵母71B發(fā)酵的楊梅果酒中共檢測出香氣成分24種。結(jié)果表明,與酵母D254相比,酵母71B發(fā)酵的楊梅酒中含有苯乙醇、十六酸乙酯和癸酸乙酯等具有特殊香氣物質(zhì)且楊梅中主要芳香物質(zhì)石竹烯等半萜烯類成分損失較小,香氣濃郁,是非常適宜傳統(tǒng)工藝下釀制楊梅果酒的酵母。以此可為楊梅的進一步深加工及釀酒工藝優(yōu)化提供參考。