王俊青，汪全，焦陽陽，李艷艷

（平頂山學(xué)院，河南平頂山467000）

南方紅豆杉[Taxus chinensis（Pilger）Rehd.]為紅豆杉科（Taxaceae）植物，為世界瀕危物種，是我國特色的傳統(tǒng)中藥材，也是紅豆杉科屬中分布最為廣泛、生長最快的植物，集藥用、材用、觀賞和科研價值于一身，素有“植物黃金”之稱[1]。其中含有抗腫瘤的有效成分紫杉烷類化合物—紫杉醇，在治療癌癥方面被認(rèn)為是當(dāng)今最具潛力抗腫瘤藥物之一[2-3]。紫杉醇主要來自紅豆杉樹皮，如果只單純開發(fā)樹皮易造成紅豆杉資源匱乏，而紅豆杉葉中的有效成分也較多，還不斷更新，從而實現(xiàn)藥用植物資源的可持續(xù)利用。研究表明，紅豆杉葉中含有以苷類為主的黃酮類化合物[4]，黃酮類物質(zhì)具有保肝、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、治療心血管系統(tǒng)等作用[5-10]，對紅豆杉黃酮的提取工藝也有相關(guān)文獻(xiàn)[11-15]，但對南方紅豆杉葉中黃酮提取工藝研究鮮見報道。

響應(yīng)面分析法是利用中心組合試驗原理設(shè)計方法并經(jīng)實驗得到相關(guān)數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的一種數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法[11]。本試驗利用超聲波的高速震動來破壞南方紅豆杉葉粉末的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，便于溶劑乙醇滲透進(jìn)入從而提取出黃酮。此法可以顯著地縮短時間和提高黃酮的提取率。繼而通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化篩選超聲輔助提取南方紅豆杉葉中總黃酮的最優(yōu)提取工藝，以期為南方紅豆杉葉中有效成分的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

南方紅豆杉葉取自湖北省襄陽市林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣站。將其置于50℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干后，粉碎，用60目篩網(wǎng)過篩備用。

1.2 儀器與試劑

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-50DE數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW-100高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA1104電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TG16G臺式高速離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司；亞硝酸鈉、六水氯化鋁、氫氧化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取105℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無水乙醇溶解，并定容于5 mL容量瓶中，配成2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考李鉑的文獻(xiàn)[15]并稍加改動：精密移取2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0 mL，分別加入一定量的蒸餾水溶液補(bǔ)充至1 mL，搖勻，配出一系列濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL。

從各標(biāo)準(zhǔn)液中分別取0.2 mL，依次加入3.4 mL無水乙醇溶液，加入0.5mol/L的NaNO2溶液0.15 mL，搖勻；再加入0.3 mol/L的AlCl3溶液0.15 mL，搖勻，放置5 min；最后加入1 mol/L的NaOH溶液1 mL，搖勻，以空白試劑作對比參照。在波長506 nm處測定其吸光度A值。并以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù) R2，見圖 1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.The standard curve line

1.3.3 提取工藝

精密稱取每份10.0 g南方紅豆杉葉粉末于50 mL小燒杯中，在一定的料液比、提取時間、乙醇濃度的條件下，用薄膜膠布密封進(jìn)行超聲提取。提取完畢后，將其溶液搖勻，進(jìn)行離心，離心速度為12 000 r/min，離心10 min，再取上清液至25 mL容量瓶中，然后加入同等濃度乙醇并定容至刻度線，搖勻。后續(xù)操作按照1.3.2中的步驟，取樣加顯色劑，平行測定數(shù)值3次。

1.3.4 黃酮提取量的計算

式中：E為黃酮提取量，mg/g；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液的稀釋倍數(shù)；v為離心液定容的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對黃酮提取量的影響

設(shè)定乙醇濃度65%，提取時間60 min的條件下，研究料液比為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）對南方紅豆杉葉中黃酮含量的影響，如圖2所示。

隨著料液比的增加，黃酮提取量曲線呈上升趨勢，在液料比為1∶30（g/mL）的時候達(dá)到最大值，隨后曲線驟然降低?？赡墚?dāng)料液比為1∶30（g/mL）時，南方紅豆杉葉粉末中溶出的黃酮量達(dá)到飽和，因此得出最佳提取液料比為1∶30（g/mL），此時總黃酮含量為84.23 mg/g。

2.1.2 提取時間對黃酮提取量的影響

設(shè)定料液比1∶30（g/mL），乙醇濃度65%的條件下，研究提取時間為 30、40、50、60、70 min 對南方紅豆杉葉中黃酮含量的影響，如圖3所示。

圖2 料液比對南方紅豆杉葉總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

圖3 提取時間對南方紅豆杉葉總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

隨時間的增長，曲線先呈上升趨勢，在60 min時達(dá)到最高點(diǎn)，而后下降，說明此時黃酮提取量最大。因此得出提取最佳提取時間為60 min，此時總黃酮的含量為84.20 mg/g。

2.1.3 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

設(shè)定料液比 1∶30（g/mL），提取時間 60 min的條件下，研究乙醇濃度為55%、60%、65%、70%、75%對南方紅豆杉葉中黃酮含量的影響，如圖4所示。

圖4 乙醇濃度對南方紅豆杉葉總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of the volume fraction of ethanol on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

總體趨勢是先升高到達(dá)一個最大值然后下降，說明此時黃酮提取量最大，因此得出最佳乙醇濃度為65%的乙醇溶液，此時總黃酮的含量為85.24 mg/g。

2.1.4 提取次數(shù)對黃酮提取量的影響

設(shè)定料液比 1∶30（g/mL），提取時間 1 h，乙醇濃度65%的條件下，研究提取次數(shù)對總黃酮提取量的影響，如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)對南方紅豆杉葉總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of the extraction times on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

由提取次數(shù)1次到2次，黃酮提取量上升比較明顯；2次以后，黃酮提取量上升不明顯。提取次數(shù)過多，不利于節(jié)省時間，且浪費(fèi)試劑，故后續(xù)響應(yīng)面分析法試驗均采用超聲輔助提取2次。

2.2 超聲輔助提取工藝研究

2.2.1 因素水平的選取

通過單因素試驗結(jié)果，確定響應(yīng)面法試驗設(shè)計的因素和水平，即選取料液比（A）、提取時間（B）、乙醇濃度（C）3個因素，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理[16-17]，以各試驗單因素最優(yōu)取值點(diǎn)為中心，上下區(qū)域各取1個水平值作為響應(yīng)面試驗設(shè)計水平，如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析法試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析

以黃酮提取量為評價指標(biāo)，設(shè)計三因素三水平17個試驗點(diǎn)的響應(yīng)面分析，其中零點(diǎn)試驗重復(fù)5次，以估計誤差，如表2所示。

利用Design expert 8.0.6軟件對表2的結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到總黃酮提取量（Y）對A、B、C的二次多項回歸模型為（公式）：

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果Table 2 The program and experimental results of response surface methodology

Y=106.16+2.77A-1.06B+1.36C+1.15AB-2.45AC+0.22BC-5.97A2-1.20B2-2.91C2

為了說明回歸方程的有效性及各因素對提取量的影響程度，對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

由表3可知，模型P＜0.000 1，回歸方程具有顯著性，可用于替代試驗點(diǎn)對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，并進(jìn)一步對回歸方程各項作顯著性檢驗。其中，料液比（A）、乙醇濃度（C）、料液比的二次項（A2）、乙醇濃度的二次項（C2）、料液比與乙醇濃度的交互項（AC）的P值均小于0.01，表明對總黃酮提取量影響極顯著；提取時間（B）、提取時間的二次項（B2）、料液比與提取時間的交互項（AB）的P值均大于0.01小于0.05，表明對總黃酮提取量影響顯著；乙醇濃度與提取時間的交互項（BC）的P值大于0.05，說明對總黃酮提取量影響不顯著。該擬合方程的二次項均為負(fù)數(shù)，所以開口向下，相應(yīng)的響應(yīng)圖見圖6～圖8。

圖6 提取時間與料液比響應(yīng)圖Fig.6 The response surface between ultrasonic extraction time and solid-liquid ratio

圖7 乙醇濃度與料液比響應(yīng)圖Fig.7 The response surface between volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio

圖8 乙醇濃度與提取時間響應(yīng)圖Fig.8 The response surface between volume fraction of ethanol and ultrasonic extraction time

失擬項檢驗的P值為0.008 8（小于0.01），表明模型充分?jǐn)M合試驗數(shù)據(jù)，受其他因素的影響不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序：料液比＞乙醇濃度＞提取時間。

2.2.3 最優(yōu)提取工藝的確定

利用Design expert 8.0.6軟件對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出理論最優(yōu)超聲提取的工藝參數(shù)為：料液比1∶30.84（g/mL），提取時間56.52 min，乙醇濃度65.75%，該條件下總黃酮的理論提取量為106.68 mg/g。為了在試驗中操作方便，提取工藝條件修正為：料液比 1 ∶31（g/mL），提取時間 57 min，乙醇濃度 66%，超聲提取2次下進(jìn)行驗證，結(jié)果見表4。

表4 試驗驗證響應(yīng)面優(yōu)化條件Table 4 Conformation results of the optimized extraction conditions

測得總黃酮提取平均值為106.58 mg/g，RSD=0.68%，結(jié)果與軟件分析得到的預(yù)測值相近，證明試驗?zāi)Ｐ瓦x擇可靠，此提取工藝可行。

3 結(jié)論

本試驗根據(jù)Box-Benhnken中心組合的試驗設(shè)計原理建立南方紅豆杉葉中總黃酮提取工藝的優(yōu)化回歸方程模型，經(jīng)方差分析該模型擬合度較好。結(jié)果表明：料液比、乙醇濃度對總黃酮提取量影響極顯著，而提取時間的影響只是顯著。同時，借助單因素實驗可知，提取次數(shù)過多，不僅費(fèi)時，還浪費(fèi)試劑，故均采用超聲輔助提取2次。因此確定超聲輔助提取南方紅豆杉葉中黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：料液比1∶31（g/mL），提取時間57 min，乙醇濃度66%，南方紅豆杉葉中總黃酮提取量為106.58 mg/g。