（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450063）

香菇（Lentinus edodes），又名花菇、香蕈，是世界第二大食用菌，也是我國的特產(chǎn)之一。香菇味道鮮美、營養(yǎng)豐富，為藥食兩用的佳品。研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖是香菇中生物活性成分，具有抗感染[1]、抗腫瘤[2]、降血糖[3]和提高免疫力[4]等多方面功效，從上世紀(jì)80年代開始，香菇多糖作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑而用于臨床，可以激活細(xì)胞免疫功能、產(chǎn)生腫瘤壞死因子，能與化療藥物合用，顯著提高抗腫瘤的效果[5-7]。近年來，香菇多糖的提取技術(shù)也日益成熟，超聲波輔助提取方法已被廣泛應(yīng)用到植物有效成分的提取中，該技術(shù)能利用超聲波的空化作用，使香菇細(xì)胞及細(xì)胞膜構(gòu)造發(fā)生改變，而不改變多糖結(jié)構(gòu)，有效成分能更快的溶入溶劑[8]，具有提高香菇多糖提取率、縮短提取時間、操作方便的優(yōu)點[9-10]。本研究以香菇為研究對象，采用超聲波輔助方法提取香菇中多糖，設(shè)計單因素試驗進(jìn)行分析，以料液比、超聲功率、溫度、超聲時間為考察因素，通過正交試驗優(yōu)化香菇多糖提取工藝，在此條件下得到最佳提取工藝條件，并使用苯酚-濃硫酸方法測定香菇多糖得率，具有提取率高、節(jié)省時間、能耗低等優(yōu)點，為香菇多糖進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

香菇：鄭州市世紀(jì)聯(lián)華超市，將干香菇于烘箱中干燥，室溫密封保存。

1.1.2 試劑

葡萄糖（GR）：上海阿拉丁試劑網(wǎng)；苯酚：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；濃H2SO4：洛陽市化學(xué)試劑廠；無水乙醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；5%苯酚溶液：黃河科技學(xué)院藥物分析實驗室自制。

1.1.3 儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；3號藥典篩（孔徑0.36 mm，50目）、5號藥典篩（孔徑0.18 mm，80目）：浙江上虞市五四儀器篩具廠；遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱：天津市華北實驗儀器有限公司；SHZ-D（Ш）循環(huán)水式多用真空泵：邦西儀器科技（上海）有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；XFB-200型粉碎機(jī)：吉首市中誠制藥機(jī)械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 香菇的預(yù)處理

將干香菇除去雜質(zhì)，于50℃烘箱中干燥至恒重，經(jīng)XFB-200型粉碎機(jī)粉碎得香菇粉末，將粉末先后過3號和5號藥典篩、裝瓶，于室溫下密封保存。

1.2.2 超聲波輔助提取香菇多糖工藝流程

香菇→干燥→粉碎→超聲→抽濾→濃縮→加蒸餾水定容→加入5%苯酚溶液→加濃H2SO4→搖勻放置→冷卻→于紫外可見分光光度計中490 nm波長下測定吸光度值（A）。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，于100 mL容量瓶中加水定容，得到10 mg/mL葡萄糖儲備液。精密移取1.0 mL儲備液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至2.0 mL，加入1.0 mL5%苯酚溶液與5.0 mL濃硫酸，搖勻，避光靜置15 min，于紫外-可見分光光度計490 nm處測定吸光度值A(chǔ)[11-12]，并以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)x，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1得線性回歸方程為：y=0.910 7x-0.184 7，R2=0.999 1，在標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，顯示出良好的線性關(guān)系。

1.2.4 樣品香菇多糖含量的測定

香菇多糖得率的計算公式為：

香菇多糖得率/%=（C×V×N/m）×100[13-14]

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的香菇多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容后的總體積，mL；N為溶液最終的稀釋倍數(shù)；m為香菇粉質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗設(shè)計

分別選取料液比、超聲功率、溫度、超聲時間為單因素，分別按照超聲波輔助提取香菇多糖工藝流程進(jìn)行多糖提取的單因素試驗[15]。

1.4 正交試驗設(shè)計

為了獲得香菇多糖的最優(yōu)提取工藝，根據(jù)單因素試驗得出的結(jié)果，根據(jù)料液比、超聲功率、溫度、超聲時間4個主要因素，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，確定香菇多糖的最優(yōu)提取工藝條件。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與單因素試驗中數(shù)據(jù)分析處理均采用OriginPro8.0軟件，每次均設(shè)置3個平行試驗，求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 最佳料液比的確定

固定超聲時間20min，超聲功率300W，溫度60℃。準(zhǔn)確稱取1.00 g香菇粉末于5個錐形瓶中，分別設(shè)置料液比為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），分別加入蒸餾水 10、20、30、40、50 mL，置于數(shù)控超聲波清洗器中，設(shè)置超聲時間20 min，冷卻至室溫，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中加蒸餾水定容，之后各移取4.0 mL溶液于50 mL容量瓶中，分別加入5%苯酚溶液2.0mL、濃硫酸10.0mL，搖勻，靜置冷卻至室溫?？瞻兹芤簽?.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490 nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得出濃度，進(jìn)而計算多糖得率。該項目進(jìn)行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.77%。料液比對香菇中多糖得率的影響見圖2。

圖2 料液比對香菇中多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liqiud rate on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖 2 可知，料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50 之間（g/mL），隨著料液比的增加，香菇多糖的得率也在增加，料液比在1∶50（g/mL）時香菇多糖得率最高，但在料液比為1∶40（g/mL）時多糖得率增加幅度大于在1∶50（g/mL）時的多糖得率增幅。這說明在一定濃度范圍內(nèi)，增加溶劑的量對香菇多糖的提取有利，當(dāng)香菇多糖的溶出達(dá)到平衡后再增加溶劑量對多糖的提取率影響不大，另外，考慮到能耗[16]，將最佳料液比確定為 1 ∶40（g/mL）。

2.1.2 最佳超聲功率的確定

固定超聲時間 20 min，料液比 1 ∶40（g/mL），溫度60℃。準(zhǔn)確稱取香菇粉末1.00 g于5個錐形瓶中，依次各加蒸餾水40 mL。置于數(shù)控超聲波清洗器中超聲20 min，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中加蒸餾水定容，之后各移取4.0mL溶液于50 mL具塞比色管中，分別加入5%苯酚溶液2.0 mL、濃硫酸10.0 mL，搖勻，靜置冷卻至室溫。空白溶液為4.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490 nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得出濃度，進(jìn)而計算多糖得率。該項目進(jìn)行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.71%。超聲功率對香菇中多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對香菇中多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖3可知，香菇多糖得率隨著超聲功率的增加先升高后降低，在超聲功率為200 W的時候多糖得率達(dá)到最高值10.52%，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于超聲波功率較低時，對香菇細(xì)胞壁破壁程度逐漸增加，使香菇中多糖溶出增多而使提取率升高，而超聲功率超過200 W時，由于功率的持續(xù)增大，超聲波的破碎效應(yīng)和熱效應(yīng)使香菇中的雜質(zhì)溶出也逐漸增多，多糖成分和雜質(zhì)可能會發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致多糖的提取率相應(yīng)下降。因此，將最佳超聲功率確定為200 W。

2.1.3 最佳超聲溫度的確定

固定超聲時間20 min，功率 200 W，料液比1∶40（g/mL）。準(zhǔn)確稱取1.00 g香菇粉末于5個錐形瓶中，依次各加40 mL蒸餾水。溫度分別為40、50、60、70、80℃，置于數(shù)控超聲波清洗器中超聲20 min，冷卻至室溫，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中定容。之后各移取4.0 mL溶液于50 mL具塞比色管中，分別加入5%苯酚溶液2.0 mL、濃硫酸10.0 mL，搖勻，靜置冷卻至室溫?？瞻兹芤簽?.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490 nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得出濃度，進(jìn)而計算多糖得率。該項目進(jìn)行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.64%。超聲溫度對香菇中多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對香菇中多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，香菇多糖得率先升高后降低，在超聲溫度為50℃時香菇多糖得率最高，這可能是由于超聲溫度50℃時，能加快溶劑分子的擴(kuò)散速度，也促進(jìn)多糖的溶出，多糖得率較高。溫度超過50℃以后，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢，尤其在50℃～60℃時，多糖得率急劇下降，則可能是由于多糖發(fā)生降解的緣故，之后多糖得率又出現(xiàn)上升的趨勢，是由于溫度的持續(xù)升高，使得多糖的氧化加重。因此，將最佳超聲溫度確定為50℃。

2.1.4 最佳超聲時間的確定

固定超聲溫度50℃，功率 200 W，料液比1∶40（g/mL）。各取1.00 g香菇粉于5個錐形瓶中，各加40 mL蒸餾水，置于數(shù)控超聲波清洗器中，超聲溫度為50 ℃。時間分別為 10、20、30、40、50 min。之后冷卻至室溫，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中定容。之后各移取4.0 mL溶液于50 mL具塞比色管中，分別加入5%苯酚溶液2.0 mL、濃硫酸10.0mL，搖勻，靜置冷卻至室溫?？瞻兹芤簽?.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得出濃度，進(jìn)而計算多糖得率。該項目進(jìn)行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.56%。超聲時間對香菇中多糖得率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對香菇中多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖5可知，隨著超聲時間的延長，多糖成分會逐漸的溶出，在超聲時間為40 min時香菇多糖得率最高，之后又出現(xiàn)降低的趨勢，這說明超聲時間過長時，多糖的結(jié)構(gòu)可能會遭到破壞，雜質(zhì)的溶出量也會增加，導(dǎo)致香菇多糖的提取率下降。因此，將最佳超聲時間確定為40 min。

2.2 正交試驗結(jié)果

選擇料液比（A）、超聲功率（B）、溫度（C）、超聲時間（D）作為正交試驗的4個因素，每個因素設(shè)計考察3個水平，研究其對香菇中多糖得率的影響，設(shè)計L9（34）正交試驗因素水平表，試驗中香菇多糖因素水平選取見表1，試驗設(shè)計結(jié)果如表2所示：

表1 香菇多糖正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factors and levels table of polysaccharides from lentinan

表2 香菇多糖正交試驗結(jié)果表Table 2 Orthogonal experiment results and analysis table of polysaccharides from lentinan

由表1和表2中香菇多糖正交試驗結(jié)果可知，影響多糖提取率的各因素主次關(guān)系為：A＞D＞C＞B，最優(yōu)工藝參數(shù)是A3B3C2D2，香菇多糖得率最高的條件為料液比 1∶50（g/mL），超聲功率 300 W，溫度 50℃，超聲時間40 min。

2.3 驗證性試驗

為進(jìn)一步驗證正交試驗結(jié)果，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲功率300 W、溫度50℃、超聲時間40 min。精密稱取1.00 g香菇粉末在香菇多糖提取正交試驗中最優(yōu)提取工藝條件下進(jìn)行試驗，平行操作3份，見表3。

表3 驗證性試驗結(jié)果Table 3 Verification testing results

如表3所示，得到的多糖得率求其平均值為11.73%，RSD=3.02%，顯示該超聲波輔助提取香菇多糖的工藝條件準(zhǔn)確可靠，結(jié)果重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

研究以香菇多糖得率為指標(biāo)，采用超聲波輔助優(yōu)化的方法提取香菇中多糖，通過單因素水平試驗分別探索料液比、超聲功率、溫度、超聲時間4個因素對香菇多糖得率的影響。在此基礎(chǔ)上設(shè)計L9（34）正交試驗因素水平表，分別篩選了上述4個因素中對香菇中多糖的提取率影響較顯著的3個水平，用四因素三水平正交試驗設(shè)計進(jìn)行香菇多糖提取工藝的優(yōu)化。試驗結(jié)果顯示，采用超聲波輔助提取香菇多糖的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶50（g/mL），超聲功率 300W，溫度50℃，超聲時間40 min。結(jié)果表明：在此工藝條件下香菇多糖得率最高，并且料液比是超聲波輔助提取過程中的關(guān)鍵因素。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗，香菇多糖平均得率為11.73%。說明該工藝條件穩(wěn)定可行，具有一定的實用價值。

香菇味道絕佳、營養(yǎng)價值高，香菇多糖藥效明顯，使得香菇在藥品和保健食品等領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。香菇多糖的提取研究能夠使香菇資源得到有效利用，為香菇多糖的深入研究開發(fā)提供參考。