邵曉,張寧,孫樂彤,趙雪,李玲
(臨沂大學生命科學學院,山東臨沂276000)
肌原纖維蛋白是肉類中含量最高最重要的蛋白質(zhì),占總蛋白的55%~60%,是人們?nèi)粘I钪袃?yōu)質(zhì)蛋白的主要來源。然而,肉類產(chǎn)品在加工過程中很容易發(fā)生蛋白質(zhì)氧化從而導致產(chǎn)品質(zhì)量下降,營養(yǎng)價值降低,甚至影響消費者的健康安全[1]。蛋白質(zhì)氧化會導致蛋白質(zhì)側鏈基團修飾,蛋白質(zhì)大分子發(fā)生交聯(lián)聚集等,從而影響肉制品的色澤、保水性和口感[2]。因此控制蛋白質(zhì)氧化,提高蛋白質(zhì)的凝膠強度是近年來急需解決的首要問題。
多酚是天然植物中的一類生物活性物質(zhì),因其抗氧化活性高而廣泛應用于食品工業(yè)中。近年來關于肉制品中添加酚類化合物的研究也有報道。玫瑰提取物可以阻止牛肉餅中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化[3],500 mg/kg的茶多酚可以降低肉糜制品中脂肪氧化硫代巴比妥酸反應物含量(thiobarbituric acid-reactive substances,TBARS)和蛋白質(zhì)羰基的含量,降低了肉糜中蛋白的巰基含量,增加了肉糜凝膠的蒸煮損失[4]。低濃度的綠茶提取物能保持肉蛋白結構和氧化穩(wěn)定性,而高濃度綠茶提取物導致肉的持水力降低,質(zhì)構變差[5]。酚類化合物既有促氧化又有抑制氧化的效果,取決于酚的種類和濃度,兒茶素、槲皮素和蘆丁在高濃度時具有促氧化作用[6]。低濃度綠原酸能有效抑制羰基的生成,適量綠原酸抑制了蛋白質(zhì)的氧化[7]。低濃度綠原酸使肌原纖維蛋白結構展開,凝膠增強,高濃度綠原酸使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集,溶解度下降,凝膠被破壞[8]。蘆丁是槲皮素的蕓香糖苷,蘆丁水解后生成槲皮素,二者都是強抗氧化劑。目前關于槲皮素和蘆丁對蛋白質(zhì)結構的影響幾乎沒有報道。本研究選用槲皮素和蘆丁這兩種多酚化合物,研究其在氧化體系中對蛋白質(zhì)氨基酸側鏈結構的影響,為多酚在肉類加工中的實際應用提供理論依據(jù)。
豬背最長?。菏惺?;槲皮素和蘆?。兌葹?8%):臨鑫正實驗器材有限公司;KCl、MgCl2、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸 [Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid,EGTA]、Na2HPO4、NaCl、NaOH、CuSO4、FeCl3、H2O2、HCl、三羥 甲 基氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris]、 乙二胺四乙酸二 鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、酒石酸鉀鈉、溴酚藍(bromophenol blue,BPB)、抗壞血酸、甘氨酸、Ellman試劑等(以上試劑均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司。
Allegra 25R高速冷凍離心機:美國Beckman公司;F-4600熒光分光光度計:日本日立公司;H-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市醫(yī)療儀器廠;優(yōu)普UPW系列超純水器:成都超純科技有限公司;Spectrum紫外可見分光光度計:上海光譜儀器有限公司。
1.3.1 肌原纖維蛋白的提取
參考Park等[10]和Feng等[11]的方法并略作修改。在市場上購買最新鮮的豬背最長肌,用刀剔除豬肉上多余的筋膜、脂肪后,將豬肉切成均勻的小塊并用絞肉機攪碎后稱重,所得的肉糜用于提取豬肉肌原纖維蛋白。稱取50 g肉樣,加4倍體積的pH 7.0緩沖液勻漿離心,棄上清液,沉淀重復洗滌3遍。沉淀再加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液,勻漿離心,棄上清液,重復2次,第3次加洗液勻漿后,用4層紗布過濾以除去結締組織等,最后用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值為6.2后離心去上清液,所得膏狀物為肌原纖維蛋白。
1.3.2 設計與處理
肌原纖維蛋白用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)稀釋為50 mg/mL,槲皮素和蘆丁分別用DMSO配制20 mmol/L的溶液。試管中先加入蛋白溶液,再加入不同量的槲皮素或蘆丁溶液,攪拌均勻后加入羥自由基氧化體系(終濃度0.01mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸、10 mmol/L H2O2),4 ℃氧化 12 h。肌原纖維蛋白的終濃度是40 mg/mL,槲皮素或蘆丁的終濃度分別是0、0.1、0.2、1、2 mmol/L。氧化反應通過添加 EDTA 終止(終濃度1 mmol/L)。以未加槲皮素、蘆丁和氧化劑的蛋白溶液作為空白對照組。
游離巰基含量采用DTNB法進行測定[12]。將樣品用甘氨酸緩沖溶液(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,4 mmol/LEDTA,pH 8.0)緩沖溶液稀釋至 1 mg/mL,吸取 1.5 mL,加入 15 μL Ellman 試劑,振蕩放置 1 h,使之充分反應,離心(12 000 g,10 min)后取上清液,在412 nm處測定吸光度。
疏水性測定采用溴酚藍結合法進行,參照Chelh等[13]描述的方法將肌原纖維蛋白用20 mmol磷酸鹽緩沖溶液稀釋為5 mg/mL的蛋白溶液。取1 mL加入0.2 mL的1 mg/mL溴酚藍(BPB),充分混勻,離心用上清液在595 nm測定吸光值。
二聚酪氨酸含量參考李學鵬等[14]方法,利用F-4600熒光分光光度儀測定吸光度,激發(fā)波長選擇325 nm,發(fā)射波長為420 nm,狹縫寬度均為10 nm,靈敏度為2。
內(nèi)源色氨酸熒光的變化通過F-4600熒光分光光度儀進行檢測。用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6)將樣品稀釋為蛋白濃度0.1 mg/mL,吸取0.1 mL置于石英比色皿中,室溫條件下283 nm激發(fā),記錄下300 nm~400 nm的發(fā)射光譜供后續(xù)分析。
用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan’s進行多重比較。所有試驗重復進行3次。結果表示為平均值±標準差。
多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響見圖1。
圖1 多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響Fig.1 Effect of polyphenols on the free sulfydryl of myofibrillar protein under oxidation conditions
從圖1中可以看出,添加槲皮素后,肌原纖維蛋白游離巰基的含量與對照組差異不顯著(p>0.05)。然而蘆丁與槲皮素不同,蘆丁具有提高游離巰基的作用。1 mmol/L和2 mmol/L蘆丁組的游離巰基含量顯著高于對照組(p<0.05)。蘆丁有效抑制了蛋白質(zhì)氧化,在添加量為1 mmol/L和2 mmol/L時,隨著濃度的上升,游離巰基含量顯著升高,高濃度多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白側鏈基團有保護作用。李玲等[7]前期對綠原酸抑制肌原纖維蛋白氧化研究中發(fā)現(xiàn),隨著綠原酸濃度的增加,游離巰基和總巰基含量增加,與該研究結果一致。而在研究草魚肌原纖維蛋白凍藏過程中的變化時,發(fā)現(xiàn)隨冷凍時間的延長,總巰基和游離巰基含量逐漸降低[15]。而本研究中,蘆丁使巰基含量增加,而槲皮素作用效果不顯著,其原因可能與氧化劑與抗氧化劑的濃度比例不同有關,還有抗氧化劑的結構基團與其功效存在一定的構效關系。
多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響見圖2。
圖2 多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of polyphenols on the BPB content of myofibrillar protein under oxidation conditions
由圖2可知,添加槲皮素和蘆丁后,能顯著增加肌原纖維蛋白的表面疏水性。隨著槲皮素的增加,肌原纖維蛋白的疏水性呈上升趨勢,其中0.2 mmol/L~2 mmol/L組與對照組和0.1 mmol/L組差異顯著(p<0.05)。隨著蘆丁含量的增加,肌原纖維蛋白的疏水性也呈上升趨勢,與槲皮素組的變化趨勢一致。高濃度的多酚進一步促進了蛋白結構的展開,更多疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面[16],疏水性增加。有研究表明,在肌原纖維蛋白中添加不同濃度的沒食子酸,疏水性會持續(xù)增加,高濃度沒食子酸作用效果更明顯,與該試驗結果一致,多酚促進了蛋白質(zhì)結構的展開[17]。
多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響見圖3。
圖3 多酚對氧化體系中肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of polyphenols on the dityrosine of myofibrillar protein under oxidation conditions
隨著槲皮素的增加,肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量呈下降趨勢。槲皮素添加1 mmol/L和2 mmol/L組與對照組差異顯著(p<0.05),說明槲皮素具有抑制蛋白質(zhì)側鏈氨基酸的聚合作用,可以降低二聚酪氨酸的含量。而0.1 mmol/L和0.2 mmol/L組與對照組差異不顯著(p>0.05),說明低含量的槲皮素抑制氨基酸聚合作用的效果較差。隨著蘆丁含量的增加,肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量也呈下降趨勢,與槲皮素組的變化趨勢一致。說明槲皮素和蘆丁都具有抑制蛋白質(zhì)側鏈氨基酸的聚合作用,保護蛋白質(zhì)免受氧化攻擊。酪氨酸對羥自由基很敏感,易被氧化發(fā)生聚合反應而生成二聚酪氨酸。有研究發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白氧化后二聚賴氨酸含量增加[18]。有人在研究兩種自由基氧化大黃魚肌原纖維蛋白時均發(fā)現(xiàn),隨氧化劑濃度的升高,二聚酪氨酸含量顯著增加[19]。有研究在肌原纖維蛋白中添加一定濃度的鞣酸或沒食子酸,能抑制二聚酪氨酸含量的增加[20]。這是因為抗氧化劑酚類物質(zhì)在氧化體系中普遍能夠起到清除自由基的作用,保護蛋白質(zhì)側鏈基團,進而維持蛋白質(zhì)的空間結構[21-22]。
槲皮素對氧化體系中肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強度見圖4。
蛋白質(zhì)氧化處理后,隨著槲皮素含量的增加,內(nèi)源色氨酸熒光強度逐漸降低。特別是在高濃度時,這可能是由于MP結構的進一步展開以及槲皮素與色氨酸殘基的相互作用引起的。槲皮素又名五羥黃酮,其羥基具有金屬離子螯合劑或油脂等氧化過程中產(chǎn)生的游離基團接受體的功能,可作為油脂、抗壞血酸的抗氧化劑。
蘆丁對氧化體系中肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強度見圖5。
圖4 槲皮素對氧化體系中肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光的影響Fig.4 Effect of quercetin on tryptophan fluoescence of myofibrillar protein under oxidation conditions
圖5 蘆丁對氧化體系中肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光的影響Fig.5 Effect of rutinum on tryptophan fluoescence of myofibrillar protein under oxidation conditions
隨著蘆丁添加量的增加,內(nèi)源色氨酸熒光強度逐漸降低,2 mmol/L組熒光強度最低,這與槲皮素的添加效果一致。蘆丁是槲皮素的蕓香糖苷,蘆丁水解后生成槲皮素。二者在結構上有共同處,在影響色氨酸內(nèi)源熒光強度的變化趨勢上一致。與此類似,綠原酸和沒食子酸也具有降低肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光強度的作用[7-8,23]。
在氧化體系中,不同濃度的槲皮素和蘆丁可以有效抑制豬肉肌原纖維蛋白的氧化。蘆丁可以增加游離巰基含量,而槲皮素在此濃度范圍內(nèi),對游離巰基含量影響不大。槲皮素和蘆丁都具有增加肌原纖維蛋白表面疏水性,降低二聚酪氨酸和內(nèi)源色氨酸熒光值的作用。由此可見,多酚對自由基引起的氧化起到一定的抑制作用??梢酝ㄟ^向肉制品中添加一定量的多酚化合物防止蛋白質(zhì)氧化。