白芳，李映紅，黃飛娟，3，*，吳正治，*

（1.深圳大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東深圳518035；2.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東深圳518020；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510080）

烏骨雞（Gallus gallus domesticus Brisson）是一種對(duì)氣虛、血虛、脾虛、腎虛、心虛等各類虛癥均有較好療效的藥用雞種，體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸含量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[1-2]。研究表明，酶解烏骨雞肌肉獲得的蛋白酶解液（即為烏雞肽），多數(shù)為相對(duì)分子質(zhì)量小于3 000 Da的小分子多肽類。這些小分子多肽的吸收機(jī)制優(yōu)于游離氨基酸，并具有氨基酸不可比擬的生理功能和改善食品感官的效應(yīng)[3-6]。主要表現(xiàn)為小分子多肽不需進(jìn)行消化，可直接被人體吸收，其吸收具有主動(dòng)性、完整性、載體功能等特點(diǎn)，并且具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力、降血壓等一系列有助于人體健康的功效。

由于復(fù)合酶解法在制備多肽中應(yīng)用普遍、酶解效果優(yōu)越，且活性炭具有吸附脫色的作用，故本研究采用復(fù)合酶解法結(jié)合活性炭的吸附脫色作用制備烏雞肽[7-9]。烏雞肽制備完成后，本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)烏雞肽的總氨基酸、游離氨基酸含量及相對(duì)分子質(zhì)量分布區(qū)間，并應(yīng)用納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Nano liquid chromatography tandem mass spectrometry，Nano LCMS/MS）技術(shù)對(duì)其組成成分及功能進(jìn)行分析。該解析流程準(zhǔn)確、可靠，不僅全面的解析了酶解活性炭吸附法制備烏雞肽的營(yíng)養(yǎng)成分、制備效果及其潛在應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也為其它小分子多肽的有效利用提供重要的分析技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

食品級(jí)木瓜蛋白酶（0.09 Au%）、風(fēng)味蛋白酶（120 LAPu%）：中國(guó)廣州裕立寶科技有限公司；食品級(jí)活性炭：上?；钚蕴繌S有限公司；乙腈（色譜級(jí)）、三氟乙酸（色譜級(jí)）、標(biāo)準(zhǔn)品（甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶）：美國(guó)sigma公司。

膠體磨：中國(guó)南通澳德精密機(jī)械公司；超濾膜（UEOS503，6 kDa）：中國(guó)天津膜天膜工程技術(shù)有限公司；島津LC20 AD高效液相色譜儀 [并配置日本島津凝膠色譜柱（TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，5 μm）]：日本島津公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 [液相色譜儀（EASY-nLC 1000）、臺(tái)式高分辨質(zhì)譜儀（LTQ Orbitrap Elite）]：美國(guó)Thermo Finnigan公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀色譜柱（ReproSil Pur C18）：德國(guó)邁克公司。

1.2 烏雞肽制備

選取江西省泰和烏骨雞，體重1.5 kg左右，雌雄各半，復(fù)合酶解法制備烏骨雞活性肽[10-11]。烏骨雞肌肉蒸煮后，絞碎再加入膠體磨進(jìn)一步磨碎，加入木瓜蛋白酶（0.09 Au%）和風(fēng)味蛋白酶（120 LAPu%）進(jìn)行水解，pH值為5.5，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間3.5 h。沸水高溫保持20 min進(jìn)行滅酶，4 000 r/min離心15 min，分去上層油脂和下層沉淀物取中層液，活性炭粉末對(duì)中層溶液進(jìn)行脫色處理，并使用相對(duì)分子質(zhì)量為6 000 Da的濾膜進(jìn)行超濾。

1.3 氨基酸組成測(cè)定

氨基酸組成分析采用2，4-二硝基氟苯柱前衍生法，操作步驟參照Liu等[3]的方法。總氨基酸檢測(cè)時(shí)，需要先將烏雞肽溶液中加入鹽酸溶液，110℃水解24 h處理；游離氨基酸檢測(cè)時(shí)，不需要進(jìn)行鹽酸水解；其它參數(shù)參照文獻(xiàn)[3]的類似方法，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布檢測(cè)

外標(biāo)法分析多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布[12]。首先，應(yīng)用高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器法（high performance liquid chromatography coupled pulsedamperometric de tection，HPLC-PAD）法分離烏雞肽溶液或標(biāo)準(zhǔn)品水溶液得到HPLC色譜圖。流動(dòng)相采用0.1%三氟乙酸/乙腈/水體系，其中乙腈含量從15%至65%均勻上升梯度洗脫30 min，烏雞肽的進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min、柱溫30℃、進(jìn)樣室溫度4℃、波長(zhǎng)220 nm。其次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間（tR）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（lgMr）作圖。

1.5 Nano LC-MS/MS成分鑒定及分析

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Nano LC-MS/MS），其中液相為納升級(jí)、液相色譜柱為C18柱[13]。流動(dòng)相為2%甲睛/0.1%甲酸/水體系，流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)椋阂?.1%甲酸含量變化為例，5%～15%、15 min，15%～90%、55 min，90%等梯度 20 min，流速為 0.1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。質(zhì)譜條件為：EASY-Spray納流電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓1.8 kV，毛細(xì)管溫度200℃。根據(jù)MS/MS圖譜中產(chǎn)生的正離子模式的碎片離子峰，用Proteome Discoverer軟件分析并通過UniProt全物種序列庫進(jìn)行搜索。

2 結(jié)果分析

2.1 總氨基酸及游離氨基酸組

總氨基酸及游離氨基酸組成見表1。

烏骨雞復(fù)合酶解肽中，共發(fā)現(xiàn)17種氨基酸（表1）?？偘被岷繛?26.51 mg/g，游離氨基酸總含量為5.69 mg/g，游離氨基酸占總氨基酸的比例為1.74%。上述結(jié)果表明：烏雞肽的游離氨基酸含量偏低，多數(shù)組分應(yīng)為肽類或蛋白質(zhì)?？偘被岷枯^高者為L(zhǎng)eu（57.01 mg/g）、Ala （55.83 mg/g）、His（54.85 mg/g）、Pro（48.05 mg/g）、Met（36.05 mg/g）和Phe（15.7 mg/g），游離氨基酸含量較高者為 Glu（1.09 mg/g）、Pro（0.64 mg/g）、Asp（0.64 mg/g）、Arg（0.60 mg/g）、Gly（0.55 mg/g）和 Ala（0.42 mg/g）。已有研究表明，Pro（48.05 mg/g）與多肽的抗氧化能力有關(guān)[10，14]，且 Leu、Met和 Phe（108.76 mg/g）均為必需氨基酸，這說明該烏雞肽營(yíng)養(yǎng)成分豐富。

表1 總氨基酸及游離氨基酸組成Table 1 Total and free amino acid composition

2.2 相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍

相對(duì)分子質(zhì)量分布區(qū)間見圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線采用甘氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、抑肽酶等4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間（tR）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（lgMr）作圖，線性方程為：y=-0.294 7x+8.338，R2=0.994 9。復(fù)合酶解活性炭吸附后烏雞肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為 0～6 918 Da，其中 6 918 Da～1 084 Da占 11.09%，1 084Da～279Da占 33.02%，279Da～124Da占27.90%，124Da～72Da占 8.56%（圖 1），主要集中在 0～1084Da，比例達(dá)到88.91%。上述結(jié)果說明：該烏雞肽含有較多利于人體吸收的小分子活性肽成分，且該復(fù)合酶解法對(duì)烏骨雞肌肉酶解充分、能用于烏骨雞小分子肽的制備。

2.3 Nano LC-MS/MS功能分析

烏雞肽的蛋白質(zhì)來源見表2。

圖1 相對(duì)分子質(zhì)量分布區(qū)間Fig.1 Molecular weight distribution range

表2 烏雞肽的蛋白質(zhì)來源Table 2 Protein source of black-bone silky fowl peptide

續(xù)表2 烏雞肽的蛋白質(zhì)來源Continue table 2 Protein source of black-bone silky fowl peptide

Nano LC-MS/MS共鑒定出源于2 287種肽段序列的107種蛋白質(zhì)，其中種類最為豐富的蛋白為參與骨骼肌修復(fù)的蛋白及酶類。針對(duì)鑒定出來的蛋白得分大于30的前39種（表2）蛋白進(jìn)行分析表明，該烏雞肽含有骨骼肌修復(fù)相關(guān)蛋白15種（比例為38.46%），這說明該烏雞肽很可能具有突出的強(qiáng)筋健骨功能。除此之外，在蛋白得分大于30的前39種蛋白中，還發(fā)現(xiàn)很多種類的其它功能蛋白，比如：參與組蛋白甲基化的組蛋白賴氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶 setd3（SETD3）[15]，在翻譯過程中不可或缺、參與損傷RNA降解的泛素-40S核糖體蛋白S27a（RS27A）[16]，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 TAO3（TAOK3）[17]，參與細(xì)胞損傷、可能成為神經(jīng)防護(hù)藥物作用靶點(diǎn)的紐蛋白（VINC）[18]。但是，膠原蛋白的發(fā)現(xiàn)是在得分14至30之間，推測(cè)可能是由于活性炭的吸附作用，造成了一些蛋白水解肽段的丟失，這也說明了以膠原蛋白肽為目的的研究開發(fā)，盡量避免使用活性炭進(jìn)行脫色處理[9]。另外，Nano LC-MS/MS分析提供的鑒定蛋白的水解肽段信息也可以作為食品深度開發(fā)的參考。

3 結(jié)論和討論

烏雞多肽，是對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物，其吸收機(jī)制優(yōu)于游離氨基酸，且具有氨基酸不可比擬的生理功能和改善食品感官效應(yīng)[2-5]。本研究對(duì)烏雞多肽的氨基酸組成進(jìn)行分析后，采用外標(biāo)HPLC法對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍進(jìn)行分析，并且結(jié)合Nano LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)一步分析其成分特征。該研究全面的分析了酶解活性炭吸附法制備烏雞肽的成分，以此指導(dǎo)產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)化。

在復(fù)合酶解活性炭吸附法制備的烏雞肽中，游離氨基酸占總氨基酸的比例為1.74%，總氨基酸含量較高者為 Leu、Ala、His、Pro、Met和 Phe，游離氨基酸含量較高者為 Glu、Pro、Asp、Arg、Gly和 Ala。相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為0至6 918 Da，其中1 084 Da以下的比例達(dá)到88.91%。Nano LC-MS/MS共鑒定出源于2 287種肽段序列的107種蛋白質(zhì)，其中種類最為豐富的蛋白為參與骨骼肌修復(fù)的蛋白及酶類。其中，得分大于30的前39種蛋白中與骨骼肌修復(fù)相關(guān)蛋白占38.46%，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)參與組蛋白甲基化的組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶setd3，在翻譯過程中不可或缺、參與損傷RNA降解的泛素-40S核糖體蛋白S27a，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TAO3，參與細(xì)胞損傷、可能成為神經(jīng)防護(hù)藥物作用靶點(diǎn)的紐蛋白等功能蛋白[28-30]?？傮w來看，活性炭吸附烏雞肽中，這些小分子多肽主要參與機(jī)體骨骼肌損傷修復(fù)，同時(shí)還具有抗癌及細(xì)胞修復(fù)的多重作用。

值得注意，本研究中膠原蛋白的發(fā)現(xiàn)是在得分14至30之間，推測(cè)可能是由于活性炭的吸附作用，造成了一些蛋白水解肽段的丟失，這也說明了以膠原蛋白肽為目的的研究開發(fā)，盡量避免使用活性炭進(jìn)行脫色處理。結(jié)合Nano LC-MS/MS分析技術(shù)提供的鑒定蛋白對(duì)應(yīng)的水解肽段信息、有目的的經(jīng)過多肽的分離和活性鑒定，可得到易于被人體吸收利用并具有特定生理活性的多肽，將能廣泛應(yīng)用于食品、保健品、藥品及化妝品等領(lǐng)域。