何壯 漆艷香 曾凡云 丁兆建 梁峻瑋 張欣 彭軍 謝培蘭 謝藝賢

摘? 要? Smy1是一種參與調(diào)控真菌生長的驅(qū)動(dòng)蛋白。本研究克隆了香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（Foc 4）驅(qū)動(dòng)蛋白基因smy1，并采用同源重組技術(shù)獲得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突變體。通過測定突變體菌絲形態(tài)、生長速度、產(chǎn)生孢子量、對香蕉苗的致病力及對氰烯菌酯的敏感性，用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生長發(fā)育及對氰烯菌酯抗藥性中的作用。結(jié)果表明，與野生型Foc 4相比，smy1敲除突變體生長緩慢、菌絲畸形、產(chǎn)孢量增加，對巴西蕉苗的致病力減弱，但對氰烯菌酯的抗性水平變化不大。由此推斷smy1基因可能在Foc 4的生長發(fā)育、產(chǎn)孢以及致病力等方面具有重要作用。

關(guān)鍵詞? 香蕉枯萎病菌;基因敲除;致病力;smy1基因

中圖分類號(hào)? S436.681? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Effects of smy1 Gene Knockout on Physiological Function of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4

HE Zhuang1，2， QI Yanxiang2， ZENG Fanyun2， DING Zhaojian2， LIANG Junwei1，2， ZHANG Xin2， PENG Jun2， XIE Peilan2， XIE Yixian2*

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract? Smy1 is a kinesin involved in the regulation of fungal growth. In the study， the smy1 kinesin gene of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc 4） was cloned. The smy1 knockout mutant of Foc 4 was obtained by homologous recombination technique. Besides observing the mycelial morphological characteristic， growth rate and sporulation of the mutants， pathogenicity to banana seedlings and sensitivity to fungicide were studied in order to reveal the role of smy1 played in the growth and development of F. oxysporum and resistance to fungicide. The results showed that， compared with the Foc 4 wild-type strain， the knockout mutants grew slowly， the mycelial morphology changed， the sporulation increased， and the pathogenicity to banana plantlets seedlings decreased， but the resistance level to fungicide changed little. This indicates that the smy1 gene may play an important role in the growth， sporulation and pathogenicity in Foc 4.

Keywords? Fusarium oxysporum; gene knockout; pathogenicity; smy1 gene

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.019

香蕉枯萎病又稱香蕉巴拿馬病，屬于檢疫性病害，它的病原菌是尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense），是一種毀滅性土傳病害，在熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛傳播，香蕉產(chǎn)業(yè)也曾因其造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]，目前還沒有任何單一的生物或者化學(xué)藥劑可以長期有效控制香蕉枯萎病。由多菌靈等苯丙咪唑類殺菌劑的大量和長期使用帶來的田間抗藥問題極其嚴(yán)重，氰烯菌酯活性高專性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，高效且價(jià)格低廉，對多種鐮刀菌引起的植物病害都已有化學(xué)防治成功的報(bào)道，作為一種新型的殺菌劑被用來防治鐮刀菌引起的危害，并取得了一定的效果[2]。

氰烯菌酯是一種結(jié)構(gòu)新穎機(jī)制獨(dú)特的新型殺菌劑，它能強(qiáng)烈抑制鐮刀菌菌絲的生長[3]，毒性低且對植物沒有藥害[4]，并對鐮刀菌屬有?；?，對其他植物病原菌如白粉病菌、稻瘟病菌等活性較差或者完全沒有活性[5]。通過熒光定位方法檢測到氰烯菌酯能抑制其敏感菌株的肌球蛋白運(yùn)動(dòng)，氰烯菌酯對Ⅰ型肌球蛋白中ATP酶的活性有很強(qiáng)的抑制作用。而氰烯菌酯對鐮刀菌獨(dú)特專一的抑制作用，是因?yàn)殓牭毒c其他真菌的Ⅰ型肌球蛋白氨基酸序列有較大差異[6]。

在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，Smy1蛋白是Ⅴ型肌球蛋白Myosin5的協(xié)作蛋白，smy1具有部分互補(bǔ)myosin2B基因的功能作用，而通過酵母雙雜實(shí)驗(yàn)表明smy1和myosin2B具有較強(qiáng)的互作關(guān)系。在鐮刀菌中，myosin5的點(diǎn)突變賦予了禾谷鐮刀菌對氰烯菌酯的抗性，不同位置的點(diǎn)突變導(dǎo)致不同程度的抗性[7]。而其他兩個(gè)肌球蛋白通過與myosin5的相互作用和調(diào)控表達(dá)來綜合調(diào)節(jié)對氰烯菌酯的抗性。有研究表明，smy1突變體致病力下降是因?yàn)殓牭毒衧my1基因?qū)Χ舅睾铣杀憩F(xiàn)為正調(diào)控，毒素下降是突變體致病力下降的主要原因[8]。因此，研究smy1基因?qū)η柘┚サ目顾幮哉{(diào)控也很有必要。

1.2.6? smy1敲除突變體對氰烯菌酯的敏感性測定和非生物脅迫檢測? 將野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體菌株在PDA平板活化一周，用打孔器在平板上打取6 mm的菌餅分別接種于含有Calcofluor White Stain（終濃度100 μg/mL），Congo Red（終濃度100 μg/mL），SDS（終濃度0.02%），Sorhitol（終濃度1.2 mol/L）和H2O2（終濃度5 mmol/L）的MM平板上，未添加任何試劑的MM平板作為對照，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長狀態(tài)，測量菌落直徑記錄并計(jì)算抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。

參照張承啟等[16]的方法對供試菌株進(jìn)行氰烯菌酯敏感性測定。將smy1敲除突變體和野生型菌株Foc 4接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)5 d得到具有新鮮活力的菌株。用打孔器從菌落邊緣打取直徑為6 mm菌餅置，分別接種在含氰烯菌酯為0、2、4、8、15、50、100、200 μg/mL 8個(gè)處理終濃度的PDA平板上。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個(gè)濃度做3個(gè)平板，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算取平均值并進(jìn)行抑制率換算，查生物統(tǒng)計(jì)幾率換算表，將藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對數(shù)值同時(shí)將抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值，進(jìn)行回歸分析，計(jì)算EC50。

1.2.7? smy1敲除突變體生物學(xué)特性分析? 生長速率和生長形態(tài)測定：將smy1敲除突變體和野生型菌株Foc 4接種到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，每天觀察菌落生長狀態(tài)，并于隔天拍照，設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

產(chǎn)孢量測定：分別從長有smy1敲除突變體和野生型菌株Foc 4（均培養(yǎng)了7 d）的PDA平板上打直徑6 mm的菌餅3個(gè)，置于100 mL PDB培養(yǎng)基中搖培3 d，過濾取濾液加水稀釋用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測算孢子濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

菌絲觀察：從恒溫振蕩培養(yǎng)3 d的smy1敲除突變體和野生型菌株Foc 4中取過濾收集的菌絲，制片于顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)并拍照記錄。

1.2.8? smy1敲除突變體致病性測定分析? 將野生型菌株Foc4和smy1敲除突變體接種于PDB中，置于調(diào)控溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床震蕩培養(yǎng)3 d，過濾收集孢子，用無菌水稀釋孢子懸浮液至106個(gè)/mL的濃度。采用盆栽傷根法接種香蕉幼苗。每株苗滴加20 mL孢子懸浮液，每個(gè)處理接種24株香蕉苗，以無菌水作為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。栽培管理讓其生長30 d，取出觀察球莖褐變程度及外部葉片黃化情況，記錄并拍照作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，縱向切開巴西蕉球莖，參考Mohamed等[17]的病情調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，記錄每株蕉苗的發(fā)病等級(jí)，最后對病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 野生型菌株對氰烯菌酯敏感性測定

在含不同濃度氰烯菌酯平板上對野生型菌株Foc 4進(jìn)行敏感性測定。由圖1知，生長7 d后，對照組長滿平板，野生型菌株Foc 4對氰烯菌酯表現(xiàn)出濃度效應(yīng)的抑制作用，氰烯菌酯濃度分別為2、4、8、15、50、100、200 μg/mL時(shí)，對應(yīng)的抑制率分別為8.75%、48.75%、72.5%、80.87%、88.13%、96.25%、98.75%，計(jì)算的EC50為6.2 μg/mL。

2.2? smy1基因的序列分析和同源性比較

野生型菌株Foc 4的smy1基因全長2943 bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，GenBank登陸號(hào)：EXL99923，編碼的蛋白由944個(gè)氨基酸殘基組成。

用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，F(xiàn)oc 4中smy1基因的氨基酸序列，與和禾谷鐮刀菌（F. gram inearum）（AAP68979.1）、木霉菌（Trichode rma harzianum）（PNP52028.1）、尖孢鐮刀菌番茄專化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici）（XP_0182 419 48.1）等幾種常見的植物病原真菌中的smy1氨基酸序列有很高的同源性（圖2）。

2.3? 擴(kuò)增smy1基因敲除重組片段

本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增根據(jù)Split-marker技術(shù)原理進(jìn)行。如圖3所示，第一輪PCR擴(kuò)增出上下游片段在電泳圖中位置與實(shí)際大小1999 bp和2065 bp相符，擴(kuò)增出的潮霉素（HYG）基因片段在圖中位置與實(shí)際1376 bp相符，第二輪PCR擴(kuò)增出上下游片段在圖中位置與實(shí)際相符，分別為2636 bp和2542 bp，二擴(kuò)產(chǎn)物可用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.4? smy1敲除突變體的PCR鑒定

通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和潮霉素篩選，挑斑培養(yǎng)獲得生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)化子96個(gè)。轉(zhuǎn)接后分別提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，用引物HPT-LBCK/ Foc 4-smy1-LBCK、HPT-RBCK/Foc 4-smy1- RBCK、HYG-F/HYG-R和Foc 4-smy1-CK-F/Foc 4-smy1- CK-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，96個(gè)轉(zhuǎn)化子中陽性轉(zhuǎn)化子有8個(gè)，挑出其中4個(gè)轉(zhuǎn)化子做后續(xù)驗(yàn)證。用引物HPT-LBCK/Foc 4-smy1-LBCK和HPT-RBCK/Foc 4-smy1-RBCK對這4個(gè)轉(zhuǎn)化子的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出2個(gè)條帶大小分別為2393、2170 bp，符合預(yù)期條帶大小，以Foc 4基因組DNA為模板擴(kuò)增作為對照（圖4A）。用引物Foc 4-smy1-CKFP/Foc 4-smy1-CKRP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯示4個(gè)轉(zhuǎn)化子無擴(kuò)增條帶，且Foc 4基因組DNA條帶位置與實(shí)際大小697 bp相符（圖4B）。用引物HYG-F/HYG-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約1376 bp的條帶，F(xiàn)oc 4為對照未擴(kuò)增出條帶（圖4C）。以上結(jié)果表明這4個(gè)轉(zhuǎn)化子的smy1基因已被敲除，將其分別命名為smy1-1、smy1-2、smy1-3和smy1-4。其中選取smy1-1敲除突變體作為研究對象進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5? smy1敲除突變體對氰烯菌酯敏感性測定

將野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體分別接種到含有不同濃度氰烯菌酯的PDA平板上，測定smy1敲除突變體和野生型菌株Foc 4對氰烯菌酯敏感性。結(jié)果表明smy1敲除突變體（EC50= 6.4 μg/mL）和野生型菌株Foc 4（EC50=6.2 μg/mL）對氰烯菌酯的敏感性差異不顯著（圖5）。

2.6? smy1敲除突變體的非生物脅迫分析

smy1敲除突變體對滲透壓、氧化壓力和細(xì)胞壁選擇性壓力均不敏感，對SDS非生物脅迫敏感（圖6）。以普通MM培養(yǎng)基做對照，1.2 mol/L的Sorhitol對野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體的抑制率分別為44.9%和14.3%，表現(xiàn)出促進(jìn)生長的特點(diǎn);5 mmol/L H2O2 對野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體的抑制率分別為59.2%和35.7%，野生型菌株Foc 4受到明顯抑制;0.02% SDS對野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體的抑制率分別為49%和71.4%，smy1敲除突變體受到的抑制較Foc 4明顯;100 μg/mL CR（Congo Red）對野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體的抑制率分別為55.1%和28.6%，野生型菌株生長受到明顯抑制;100 μg/mL CFW（Calcofluor White）對野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體的生長抑制率分別為61.2%和50%。

2.7? smy1敲除突變體的生長特性分析

將smy1敲除突變體和野生型菌株Foc 4接種在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)7 d，每天測量菌落直徑。結(jié)果表明，野生型菌株Foc 4生長速度較快，7 d后菌絲幾乎長滿平板，而smy1敲除突變體菌絲生長緩慢（圖7A，圖7B）。通過光學(xué)顯微鏡觀察野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體的菌絲發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株Foc 4菌絲相比smy1敲除突變體的菌絲生長出現(xiàn)畸形（圖7C，圖7D）。收集統(tǒng)計(jì)菌株生長的孢子量，結(jié)果顯示野生型菌株Foc 4的孢子濃度約為2.605×106個(gè)/mm2，smy1敲除突變體的孢子數(shù)量濃度約為6.053×106個(gè)/mm2（圖7E），smy1敲除突變體產(chǎn)孢量相對增加。

A： Foc 4 和smy1 菌落形態(tài)（2、4、6和7 d）;B：菌落生長直徑;C：產(chǎn)孢量比較;D：Foc 4菌絲生長形態(tài);E：smy1菌絲生長形態(tài)。誤差線代表3次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同小寫字母代表差異顯著（P<0.05）。

A： The colonies morphology of Foc 4 and smy1 （2， 4， 6 and 7 d）; B： The diameter of colonies; C： The conidia of the smy1 mutants and Foc 4; D： The mycelial growth form of Foc 4; E： The mycelial growth form of smy1 mutants. The error bar represents the standard error of three biological repetitions， and different lowercase letters represent significant difference （P<0.05）.

2.8? smy1基因敲除突變體的致病性

將野生型菌株Foc 4和smy1敲除突變體接種巴西蕉苗，讓其侵染1個(gè)月，觀察檢測發(fā)現(xiàn)接種野生型菌株Foc 4的蕉苗出現(xiàn)黃化枯萎現(xiàn)象的葉片數(shù)量較多，甚至出現(xiàn)植株整株死亡的現(xiàn)象，縱向切開球莖測量球莖褐化部位占比并分級(jí)，大部分病級(jí)嚴(yán)重度達(dá)到5～7級(jí);接種過smy1敲除突變體的巴西蕉苗出現(xiàn)部分植株下部少量葉片變黃現(xiàn)象，切開球莖觀察到部分球莖呈現(xiàn)輕微的褐化現(xiàn)象，病害癥狀較輕;用H2O作為對照組的蕉苗生長狀態(tài)良好，沒有出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象，對其切開球莖也未觀察到褐化現(xiàn)象（圖8A）。根據(jù)病情分級(jí)計(jì)算病情指數(shù)結(jié)果，接種野生型菌株Foc 4的平均病情指數(shù)為67.50，接種smy1敲除突變體的巴西蕉苗平均病情指數(shù)為37.50，接種smy1突變體的香蕉苗病情指數(shù)低于接種野生菌株Foc 4的病情指數(shù)（圖8B），突變體的致病能力下降。表明smy1基因在野生型菌株Foc 4的侵染香蕉苗和致病性方面起著重要作用。

3? 討論

本研究利用同源重組原理，經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得了smy1基因的敲除突變體，與尖孢鐮刀菌野生型菌株相比，其菌絲長很密集，生長速度下降，且菌絲呈現(xiàn)不規(guī)則的發(fā)散狀，但是產(chǎn)孢量增加，除對SDS敏感之外，對其他的細(xì)胞壁選擇性壓力、氧化壓力和滲透壓力表現(xiàn)均不敏感。通過其致病力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種過突變體的香蕉幼苗比接種野生菌的香蕉苗發(fā)病癥狀輕，這與劉秀梅[7]的研究敲除smy1基因致病力結(jié)果一致，切開球莖，通過病情分級(jí)測量得出其侵染范圍低于野生菌株的侵染范圍。由此表明smy1基因在調(diào)控鐮刀菌致病力方面起著重要作用。用氰烯菌酯做敏感性測試，發(fā)現(xiàn)其對smy1敲除突變體的EC50值與Foc 4野生型菌株沒有顯著差異，表明突變體對氰烯菌酯的抗性沒有顯著變化，未能達(dá)到預(yù)期效果，這與Liu等[18]的結(jié)果有所不同，推測在尖孢鐮刀菌中smy1基因的突變對氰烯菌酯的抗藥性不明顯。

綜上所述，smy1基因的敲除導(dǎo)致香蕉枯萎病菌生長緩慢，產(chǎn)孢增加，菌絲畸形，致病力減弱。推測smy1基因在香蕉枯萎病菌的生長發(fā)育及致病力等方面發(fā)揮著重要作用，但對香蕉枯萎病菌致病性的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

李曉娜， 曾小紅， 張慧堅(jiān)， 等. 世界香蕉枯萎病防治研究進(jìn)展[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)， 2017（6）： 71-73.

張承啟. 新型殺菌劑氰烯菌酯對禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2016.

Bollen G J， Scholten G. Acquired resistance to benomyl and some other systemic fungicides in a strain of Botrytis cinerea in cyclamen[J]. Netherlands Journal of Plant Pathology， 1971， 77（3）： 83-90.

Chinthalapudi K， Taft M H， Martin R， et al. Mechanism and specificity of pentachloropseudilin-mediated inhibition of myosin motor activity[J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（34）： 29700-29708.

高啟迅. 小麥赤霉病菌對常用殺菌劑的抗性研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2016.

李恒奎， 陳長軍， 王建新， 等. 禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的敏感性基線及抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究[C]//中國植物病理學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)暨植物病理學(xué)報(bào)創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會(huì)論文集. 保定. 2005： 42.

劉秀梅. 亞洲鐮孢菌（Fusarium asiaticum）對氰烯菌酯抗性水平調(diào)控機(jī)制的研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

Zheng Z， Hou Y， Cai Y， et al. Whole-genome sequencing reveals that mutations in myosin-5 confer resistance to the fungicide phenamacril in Fusarium graminearum[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 8248.

劉遠(yuǎn)征， 漆艷香， 曾凡云， 等. 香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種β1-微管蛋白基因的功能分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018， 39（6）： 1153-1160.

王小琳， 李春強(qiáng)， 楊景豪， 等. 香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種cat1基因敲除與表型分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2017， 38（2）： 335-342.

符冬妹. 基于致病性喪失突變體Focr4-1366的香蕉枯萎病菌致病相關(guān)基因功能分析[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2015.

王飛燕， 郭立佳， 楊臘英， 等. 尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種fpd1基因敲除與表型分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（8）： 1462-1468.

韓小路， 白靜科， 張? 瑋， 等. PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢Colletotrichum fructicola原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 25（3）： 442-449.

漆艷香， 謝藝賢， 張? 欣， 等. 香蕉枯萎菌基因組DNA提取方法的研究[J]. 生物技術(shù)， 2004， 14（6）： 32-34.

Li C， Shao J， Wang Y， et al. Analysis of banana transcriptome and global gene expression profiles in banana roots in response to infection by race 1 and tropical race 4 of Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 851.

張承啟. 新型殺菌劑氰烯菌酯對禾谷鐮刀菌的作用機(jī)制研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2016.

Mohamed A A， Mak C， Liew K W， et al. Early evaluation of banana plants at nursery stage for Fusarium wilts tolerance[C]//Molina A B， Masdek N H， Liew K W. Banana Fusarium wilt management： towards sustainable cultivation. Rome： INIBAP Press， 2001： 174-185.

Liu X， Zheng Z， Li B， et al. A myosin passenger protein gene （FaSmy1） is an essential regulator of cell development， pathogenicity， DON biosynthesis， and resistance to the fungicide phenamacril in Fusarium asiaticum[J]. European Journal of Plant Pathology， 2017， 148（3）： 709-722.