宋智青 丁昌江 欒欣昱 陳 浩

(內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010051)

在電場生物效應(yīng)研究領(lǐng)域，主要涉及利用高壓電場對(duì)生物體進(jìn)行誘變[1]、滅殺[2-4]，進(jìn)而輔助外源基因轉(zhuǎn)移等[5]。隨著電磁輻射與生物科學(xué)交叉領(lǐng)域的發(fā)展，高壓電場生物效應(yīng)的研究逐步從宏觀生物效應(yīng)向微觀機(jī)制發(fā)展，如從電場對(duì)農(nóng)作物或微生物產(chǎn)量和質(zhì)量的影響向電場對(duì)細(xì)胞、大分子等的影響方向深入。近年來，高壓電場微觀生物效應(yīng)研究主要集中于細(xì)胞和分子水平，用于研究的電場也主要是脈沖電場或勻強(qiáng)電場。大量研究表明，電場作用能引起生物體細(xì)胞的凋亡和壞死[6-7]、細(xì)胞膜電穿孔[8-9]、酶活性改變[10]、DNA和RNA損傷等[11-12]。非均勻電場由于其不僅有電場作用，還涉及電暈放電、等離子體注入、二次電子發(fā)射等多因素綜合作用，其機(jī)制比較復(fù)雜，也較少被應(yīng)用于生物效應(yīng)，尤其是誘變育種的研究。截至目前，針對(duì)高壓電暈電場(high voltage corona electric field，HVCEF)生物效應(yīng)的研究并不常見，尤其是高壓電暈電場與生物體在細(xì)胞水平或分子水平作用機(jī)理尚鮮見報(bào)道。本文綜述了高壓電暈電場對(duì)大腸桿菌及其他物種的生物效應(yīng)，綜合分析了電暈電場的生物效應(yīng)機(jī)制，以期為高壓電暈電場生物效應(yīng)的技術(shù)應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 高壓電暈電場生物技術(shù)及裝置

高壓電暈電場是指能產(chǎn)生局部電暈放電的非均勻電場，在非均勻電場中，電極的尖端處電力線最集中，電場強(qiáng)度也最大，當(dāng)加上高壓后，由于空氣游離會(huì)在電極附近產(chǎn)生局部電暈放電。電暈電場生物效應(yīng)的裝置基本結(jié)構(gòu)詳見圖1。高壓電源可接不同輸出的電源。電極系統(tǒng)須有尖端，一般為單針-板極、多針-板極、多針-網(wǎng)極、線-板極等。以多針-板極電極系統(tǒng)為例，高壓電極為針，針間距可調(diào)，接地極一般為平面鋁板，極距一般連續(xù)可調(diào)。

圖1 高壓電暈電場誘變裝置Fig.1 Mutagenesis device of high voltage corona electric field

根據(jù)靜電學(xué)理論可知，帶電導(dǎo)體所攜帶的電荷集中在導(dǎo)體的表面，面電荷密度與導(dǎo)體的曲率半徑密切相關(guān)，針尖表面的面電荷密度遠(yuǎn)高于其他部位，因此其附近的電場強(qiáng)度也較強(qiáng)。圖1加高壓的電極為針狀陣列電極，電位升高到一定程度時(shí)，針尖處積累的大量電荷所產(chǎn)生的強(qiáng)電場使針尖周圍的空氣電離，從而產(chǎn)生局部放電，出現(xiàn)暈光。高壓電暈電場誘變裝置中采用多針陣列電極，與單針電極相比，多針陣列電極起暈電壓較低，且這種電極間的相互作用可使空間電場分布更均勻，可以在更寬的電壓范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的電暈放電，更適用于生物效應(yīng)和誘變機(jī)制研究[13]。

目前，多針-板電極結(jié)構(gòu)的高壓電暈電場已被廣泛應(yīng)用于生物物料干燥及靜電除塵[14-17]。高壓電暈電場生物技術(shù)是非均勻電場、電暈放電、等離子體注入、二次電子發(fā)射等多種物理因素協(xié)同作用產(chǎn)生的，其作用機(jī)制與高壓均勻電場(high voltage electrostatic field，HVEF)不同，且具有裝置簡單、生物效應(yīng)明顯、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已被國家專利局正式授為實(shí)用新型專利[18]。近年來，高壓電暈電場生物技術(shù)已被廣泛應(yīng)運(yùn)于生物誘變、轉(zhuǎn)基因及滅菌等方面[1，2，19-22]。

2 高壓電暈電場生物效應(yīng)研究進(jìn)展

2.1 高壓電暈電場對(duì)大腸桿菌誘變研究

近年來，內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)電磁場技術(shù)及應(yīng)用課題組以野生型大腸桿菌K12W3110為研究對(duì)象，基于lac操縱子表達(dá)調(diào)控原理，運(yùn)用多針-板電暈電場、平板均勻電場、平板變頻電場對(duì)野生大腸桿菌K12W3110進(jìn)行誘變研究，篩選得到lacI基因突變的大腸桿菌菌株[19-20，23]，與低能等離子體誘變[24]相同菌株的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)4種物理誘變技術(shù)在最佳誘變參數(shù)條件下，高壓電暈電場的誘變率最高，是對(duì)照組的12.48倍，且存活率也較高，證明高壓電暈電場誘變具有損傷低和突變率高的特點(diǎn)。根據(jù)靜電學(xué)知識(shí)可知，在平板均勻電場中，由于外電離因素影響而產(chǎn)生帶電粒子，當(dāng)電壓升高時(shí)，帶電粒子的數(shù)量和速度隨之增加，進(jìn)而發(fā)生電子碰撞電離，造成輝光放電，電壓繼續(xù)升高時(shí)會(huì)造成空氣擊穿，因此均勻電場不產(chǎn)生電暈放電，說明高壓均勻電場不會(huì)電暈放電，其對(duì)大腸桿菌有一定誘變效應(yīng)，但作用效果不強(qiáng)[25]。高壓電暈電場可產(chǎn)生電暈放電，激發(fā)等離子體。宿鵬浩等[26]對(duì)電暈放電電離區(qū)形貌研究發(fā)現(xiàn)，在常壓空氣中，放電中受激物質(zhì)主要是N2，單一等離子體N＋在損傷較大的情況下，對(duì)大腸桿菌的誘變率低于高壓電暈電場，但等離子體誘變效果優(yōu)于均勻電場(表1)。

表1 不同物理誘變技術(shù)對(duì)大腸桿菌W3110的誘變效果比較[19-20，23-24]Table1 Comparison of the mutagenic effects of different physical mutation technologies on E.coli.W3110[19-20，23-24]

由表2可知，高壓電暈電場誘變幾乎包含了lacI基因的所有突變類型，包括突變熱點(diǎn)±TGGC、堿基置換、單堿基插入缺失、多堿基插入缺失，特別是包含280 bp缺失的大片段結(jié)構(gòu)變異，說明高壓電暈電場誘變具有突變譜廣的特點(diǎn)。CK的主要類型在lacI突變熱點(diǎn)±TGGC處，占所有突變類型的69%；高壓電暈電場組的突變類型則更為廣泛，±TGGC處的突變僅占所有突變類型的26%；AT到TA的顛換提高至21%。從堿基對(duì)的變化來看，高壓均勻電場和高壓變頻電場突變結(jié)果類似，而與高壓電暈電場差異較大，說明高壓電暈電場誘變機(jī)制具有獨(dú)特性，誘變效應(yīng)是協(xié)同作用的結(jié)果。

表2 不同誘變技術(shù)引起的lacI基因突變譜[19-20，23-24]Table2 Spectra of lacI gene mutants induced by different mutation technologies[19-20，23-24]

2.2 高壓電暈電場對(duì)其他物種生物效應(yīng)的研究

楊曉桐等[1]利用單針-板高壓電暈電場2次連續(xù)誘變出芽短梗霉菌，突變株多糖產(chǎn)量高達(dá)9.57 g·L-1，約為原始菌株的3倍，發(fā)酵液顏色為米白色，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，突變株性狀和產(chǎn)量無明顯變化，傳代穩(wěn)定；宋智青等[18，21]利用高壓電暈電場對(duì)黃霉素產(chǎn)生菌和納豆芽孢桿菌進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)誘變后均篩選出高效高產(chǎn)的突變菌株。Wang等[27]采用多針-板電暈電場處理棉花種子，種子表面的傅里葉紅外光譜檢測表明，電暈放電形成的等離子體活性物質(zhì)對(duì)種子表面有化學(xué)和物理刻蝕作用，使種子表面脊?fàn)钔黄鹱儽。a(chǎn)生2 μm級(jí)的刻蝕裂紋，這種化學(xué)和物理刻蝕在種子萌發(fā)理化反應(yīng)過程中起著非常重要的作用，有利于棉花種子的萌發(fā)，表明高壓電暈電場是一種環(huán)保的、有效的誘變方式；Schmiedchen等[28]認(rèn)為小于35 kV·m-1的靜電場可引起無脊椎動(dòng)物的行為反應(yīng)，且對(duì)無脊椎動(dòng)物和植物的生物學(xué)功能未產(chǎn)生不良反應(yīng)，當(dāng)場強(qiáng)水平大于35 kV·m-1時(shí)，會(huì)引起無脊椎動(dòng)物和植物生理學(xué)和形態(tài)學(xué)上的不良反應(yīng)，而這些反應(yīng)是由于電暈放電作用引起的；Mikhaylin等[29]利用單針-板電暈電場處理β-乳球蛋白發(fā)現(xiàn)，高壓電暈電場能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的活性位點(diǎn)形成親核酶作用，從而釋放生物活性肽和功能活性肽，使β-乳球蛋白水解率提高66%；袁麗麗等[30]利用單針-板高壓電暈電場誘變北蟲草分生孢子，獲得了與原始菌株拮抗線明顯的突變菌株，突變株經(jīng)簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)分析，發(fā)現(xiàn)兩者電泳圖譜有明顯的差異，說明突變株在DNA水平上發(fā)生了變異，具有遺傳多樣性，且中性突變率較高；那日等[31]采用高壓電暈電場處理細(xì)枝巖黃芪種子，并以該種子為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)電暈電場處理可提高愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率，促進(jìn)愈傷組織的形成。綜上，高壓電暈電場作用于生物或大分子，既有電暈放電產(chǎn)生等離子體的直接刻蝕作用，又有等離子體活性成分的間接作用和非均勻電場的作用。

3 高壓電暈電場生物效應(yīng)機(jī)制

3.1 高壓非均勻電場的電穿孔作用

細(xì)胞膜自身為介電材料，當(dāng)細(xì)胞膜在正常環(huán)境狀態(tài)下，其自身維持較低的電位差，但當(dāng)細(xì)胞處于高壓電場環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜的電位差會(huì)發(fā)生改變，出現(xiàn)跨膜電位，當(dāng)跨膜電位超過臨界值，就會(huì)使細(xì)胞膜崩解；當(dāng)外加高壓電場后，細(xì)胞膜各點(diǎn)受到電場力的作用，細(xì)胞膜上的分子或離子會(huì)發(fā)生碰撞、吸引、排斥等一系列運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞電穿孔使膜內(nèi)分子間相互作用力的平衡遭到破壞[8]。白愛枝等[23]研究結(jié)果表明，經(jīng)高壓電場處理后，大腸桿菌的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁損傷嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)容物溢出，這是高壓非均勻電場對(duì)細(xì)胞的電穿孔作用[18-19，32]。

3.2 離子風(fēng)的直接刻蝕和注入作用

電暈放電可以使空氣電離產(chǎn)生較多低溫等離子體，這些等離子體由 OH、H2O2、O、N＋、N2＋、O-2等自由基、活性原子和正負(fù)離子組成，并在電場作用下形成離子風(fēng)。Zhang等[33]研究針-板電暈場對(duì)水的作用發(fā)現(xiàn)，離子風(fēng)速度可以達(dá)到7 m·s-1，對(duì)其下面的水面沖擊較大，側(cè)面說明低溫等離子體對(duì)其下面的物質(zhì)與細(xì)胞沖擊相當(dāng)，等離子體注入細(xì)胞誘變效應(yīng)顯著。由于注入的各種離子和胞內(nèi)分子發(fā)生了質(zhì)量沉積、能量交換和電荷轉(zhuǎn)移等反應(yīng)，離子注入會(huì)造成生物材料的嚴(yán)重刻蝕損傷[27]。此外，沉積的離子與細(xì)胞內(nèi)的生物分子或原子的替換、重組和復(fù)合，以及電荷轉(zhuǎn)移，改變了細(xì)胞的電位分布，加速了DNA突變，產(chǎn)生遺傳多樣性[34-36]，進(jìn)一步加強(qiáng)了高壓電暈電場的誘變效應(yīng)。而平板均勻電場由于不發(fā)生電暈放電，沒有等離子體刻蝕注入作用，因此誘變效應(yīng)不明顯。

3.3 等離子體活性物質(zhì)與生物體的作用

Rybenkov等[37]發(fā)現(xiàn)常壓等離子體處理后的細(xì)胞，其細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，且該變化是非致死可恢復(fù)的。有研究者利用常壓低溫等離子體誘變處理了鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、鏈霉菌、放線菌等微生物，結(jié)果表明其可以使微生物一些蛋白質(zhì)酶活性發(fā)生改變、DNA損傷等一系列生理生化和細(xì)胞分子水平的變化，進(jìn)而造成微生物突變，且常壓低溫等離子體誘變技術(shù)是一種高效環(huán)保的誘變技術(shù)[38-39]。由于高壓電暈電場和生物體是在開放的大氣環(huán)境下進(jìn)行作用的，因此，常壓低溫等離子體與生物體作用是非常重要的因素?？諝饣蛘邩悠坊|(zhì)中的氧氣被離解和激發(fā)，會(huì)產(chǎn)生各種活性氧成分(reactive oxygen species，ROS)。ROS是電磁因果鏈原初作用中連接物理和生物解釋的一個(gè)重要標(biāo)志物，等離子體作用后，在細(xì)胞基質(zhì)中產(chǎn)生的ROS進(jìn)入細(xì)胞，從而與細(xì)胞中的大分子發(fā)生作用，如與蛋白質(zhì)作用形成超氧化物，或與DNA作用發(fā)生DNA的烷基化或鏈間交聯(lián)，從而改變細(xì)胞的代謝活性和遺傳特性，其為等離子體在不造成細(xì)胞破裂和致死的條件下，造成細(xì)胞內(nèi)遺傳和代謝變化的主要作用方式之一[40-43]。

3.4 等離子體注入與二次電子發(fā)射對(duì)生物體的影響

研究表明，等離子對(duì)生物體是一種表面的作用[44]，等離子體產(chǎn)生的活性粒子在生物物質(zhì)中的滲透深度缺乏定量的闡釋[45]。黃旭初等[46]研究表明，200 keV的Ⅴ＋注入花生種子的最大射程是可達(dá)800 μm，而高壓電暈電場生物技術(shù)裝置產(chǎn)生的等離子體的能量也可達(dá)keV量級(jí)以上，表明等離子體完全可以作用于生物體內(nèi)部。此外，等離子體作用生物體后即使射程并不深，但由于信號(hào)的傳導(dǎo)，可以引起長程旁效應(yīng)，即在個(gè)體水平上存在輻射的長程旁效應(yīng)，進(jìn)而引起損傷突變[47]。大量研究表明，高能離子對(duì)生物體的輻射損傷實(shí)際上是一系列低能事件的綜合結(jié)果[48-49]。keV能量級(jí)等離子體注入生物體后，首先與生物分子相互作用，形成二次電子，二次電子發(fā)射后可造成DNA分子鏈斷裂或堿基損傷[50]。Song等[51]研究也證明等離子體注入后的二次電子發(fā)射是引起大腸桿菌突變的重要原因之一。

4 高壓電暈電場生物技術(shù)的優(yōu)勢及不足

4.1 優(yōu)勢

與其他大部分物理誘變技術(shù)相比，高壓電暈電場處理裝置十分簡單，只需高壓電源和電極系統(tǒng)，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要隨時(shí)搬運(yùn)，占地面積小。若處理某些樣品需要無菌條件時(shí)，只需將電極系統(tǒng)放入超凈工作臺(tái)即可。此外，該裝置是在常溫常壓下進(jìn)行，也可根據(jù)處理需要，將電極系統(tǒng)放入儲(chǔ)氣腔體來改變工作氣壓和氣體種類；實(shí)驗(yàn)過程對(duì)樣品基本沒有要求，且不需要專人操作，購置成本低[18]。

高壓電暈電場生物效應(yīng)明顯，特別是誘變效應(yīng)，該技術(shù)具有高存活率、低損傷、高突變率，產(chǎn)生的突變譜廣，處理后代中中性突變較多，有利于篩選優(yōu)良種質(zhì)等優(yōu)勢[19，30]。近年來由于單一誘變因子的疲勞效應(yīng)，研究學(xué)者逐步嘗試多種物理因子的復(fù)合誘變，這種復(fù)合誘變產(chǎn)生了明顯的生物效應(yīng)和較好的誘變效果[52-53]。而高壓電暈電場的誘變也是多因子復(fù)合作用的結(jié)果。

高壓電暈電場基于非均勻電暈放電，屬于非電離輻射誘變技術(shù)，實(shí)驗(yàn)過程無需防護(hù)，實(shí)驗(yàn)裝置能耗低，不排放有害氣體和廢棄物。實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的等離子體活性物質(zhì)(如O3)具有強(qiáng)氧化性且氧化產(chǎn)物對(duì)環(huán)境無污染性，被廣泛用于污水、引用水處理、食品保鮮、醫(yī)學(xué)消毒、特別是空氣凈化和廢氣處理等領(lǐng)域，對(duì)環(huán)境保護(hù)非常有益[54-55]。

4.2 不足

高壓電暈電場屬于非均勻電場，在處理生物體時(shí)，會(huì)造成單一生物個(gè)體接收到的劑量不均勻。實(shí)驗(yàn)過程中由于針和針之間有一定距離，誘變個(gè)體因接收劑量不同，誘變效果有一定差異。處在針極正下方的生物體，誘變效應(yīng)會(huì)更加明顯，離高壓針極相對(duì)較遠(yuǎn)的生物體誘變效應(yīng)較差。高壓電暈電場生物效應(yīng)是由多因子復(fù)合作用形成的，而復(fù)合誘變的作用機(jī)制研不是單因素的簡單疊加，造成該技術(shù)作用機(jī)制的研究較為困難。

5 展望

目前高壓電暈電場生物效應(yīng)的研究仍處于材料基礎(chǔ)階段，尚需大量的基礎(chǔ)材料積累，以對(duì)高壓電暈電場生物技術(shù)體系中復(fù)雜的生物物理化學(xué)過程進(jìn)行更深入、細(xì)致的研究:建立數(shù)學(xué)模型，形成全面的高壓電暈電場生物技術(shù)理論體系，為高壓電暈電場在誘變育種及其他領(lǐng)域如生物醫(yī)學(xué)、干燥、材料科學(xué)、能源環(huán)境以及國防安全等更廣泛應(yīng)用提供實(shí)踐指導(dǎo)。下一步可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行更深入的研究。對(duì)電暈放電所產(chǎn)生等離子體的物理特性進(jìn)行診斷，以確定電暈放電對(duì)生物效應(yīng)的貢獻(xiàn)率；建立變異株的高通量的篩選體系，

對(duì)穩(wěn)定突變株進(jìn)行全基因組重測序，研究高壓電暈電場生物技術(shù)的損傷修復(fù)機(jī)制，從表型到基因?qū)用嫣接懜邏弘姇炿妶錾锛夹g(shù)誘變特點(diǎn)和分子機(jī)制；檢測生物體內(nèi)ROS水平、自由基含量及DNA鏈斷裂情況，為高壓電暈電場生物技術(shù)作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)；利用高壓電暈電場對(duì)生物大分子進(jìn)行體外處理，并檢測誘變后生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的變化。