王小樂 遲天華 劉穎鑫 王海濱 張 飛 陳發(fā)棣 房偉民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)部景觀設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095)

菊花(Chrysanthemum morifolium)為原產(chǎn)于我國(guó)的宿根花卉，是世界四大鮮切花之一，也是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有極高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。目前菊花種質(zhì)資源主要依靠田間保存，需消耗大量人力物力，且易受到澇害、蟲害、病害等影響，導(dǎo)致品種混雜、種性退化，甚至品種丟失[3-5]。

緩慢生長(zhǎng)離體保存技術(shù)是指在人為控制下，通過改變培養(yǎng)環(huán)境、在培養(yǎng)基中添加化學(xué)物質(zhì)等手段，使植株的生長(zhǎng)速度減緩，延長(zhǎng)繼代擴(kuò)繁的時(shí)間，從而達(dá)到中長(zhǎng)期保存的目的[6]。該技術(shù)具有不易受外界環(huán)境影響、占據(jù)空間小、節(jié)省人力和物力、可快速繁殖等特點(diǎn)[7-9]，近幾年已被廣泛運(yùn)用于黃獨(dú)[10]、薄荷[11]、千里光[12]等多種園藝作物的種質(zhì)資源保存。國(guó)外已采用離體保存技術(shù)保存菊花種質(zhì)資源[13]，但目前在國(guó)內(nèi)相關(guān)研究并不常見，王艷芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)在23±2℃下，利用添加不同蔗糖與甘露醇配比的培養(yǎng)基對(duì)切花菊神馬試管苗進(jìn)行離體保存，成活率達(dá)到60.00%，但其未采用低溫庫保存以進(jìn)一步提高存活率和延長(zhǎng)保存周期。此外，菊花不同基因型的生長(zhǎng)特性差異明顯，對(duì)保存條件也有不同要求[15]，需要開展進(jìn)一步研究以形成較為完善的低溫離體保存方案。

本試驗(yàn)選取4個(gè)田間生長(zhǎng)類型差異較大的菊花品種，在7±2℃離體庫中研究不同濃度甘露醇、蔗糖對(duì)菊花離體保存的影響，以期探索針對(duì)不同生長(zhǎng)類型菊花品種合適的低溫離體保存方案，為菊花種質(zhì)資源低溫離體保存提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4個(gè)田間生長(zhǎng)類型差異較大的菊花品種蒙娜麗莎黃、橙安娜、小洋菊和南農(nóng)橙乒乓無菌苗均來自于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)菊花種質(zhì)資源保存中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 4個(gè)菊花品種離體生長(zhǎng)狀況比較 4個(gè)品種分別接種10株帶1個(gè)腋芽的莖段(每試管1株)，并均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，2個(gè)月后分別測(cè)量各品種菊花的株高、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)等指標(biāo)。以MS＋7 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8±0.2，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強(qiáng)度為 40～50 μmol·m-2s-1，光照時(shí)間為 8:00-20:00和23:00-2:00。

1.2.2 試管苗低溫離體保存比較 以MS＋7.0 g·L-1瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加 45、60、75、90 g·L-1蔗糖和 0(CK)、5、10、15、20 g·L-1的甘露醇，30 g·L-1蔗糖處理作為對(duì)照，培養(yǎng)溫度為7±2℃外，其他培養(yǎng)條件同1.2.1。每3個(gè)月觀察統(tǒng)計(jì)1次試管苗成活率、綠葉數(shù)。

1.2.3 試管苗組織學(xué)觀察 低溫保存12個(gè)月后取最優(yōu)濃度甘露醇處理的蒙娜麗莎黃、橙安娜、小洋菊和南農(nóng)橙乒乓的莖段、葉片，以常溫下MS＋7 g·L-1瓊脂＋30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)(60 d繼代一次)的試管苗為對(duì)照，石蠟切片，番紅-固綠染色后置于DM6B熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)下拍照觀察。

1.2.4 恢復(fù)生長(zhǎng) 低溫保存結(jié)束后取保存效果最好的處理轉(zhuǎn)至正常條件下恢復(fù)培養(yǎng)?；謴?fù)培養(yǎng)45 d后測(cè)量統(tǒng)計(jì)菊花株高、葉片數(shù)量、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)度和根系數(shù)。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性鑒定 取恢復(fù)生長(zhǎng)后植株嫩葉，采用CTAB法[16]提取DNA，SSR分子標(biāo)記檢測(cè)遺傳穩(wěn)定性；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染法[17-18]染色。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPASS 20.0和Microsoft Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫下4個(gè)菊花品種離體生長(zhǎng)狀況比較

由表1可知，培養(yǎng)2個(gè)月后，株高從高到低依次為蒙娜麗莎黃＞小洋菊＞橙安娜＞南農(nóng)橙乒乓，且各品種間差異顯著；葉片數(shù)也表現(xiàn)為蒙娜麗莎黃＞小洋菊＞橙安娜＞南農(nóng)橙乒乓，其中蒙娜麗莎黃的葉片數(shù)顯著多于其他品種；莖粗則表現(xiàn)為南農(nóng)橙乒乓＞橙安娜＞小洋菊＞蒙娜麗莎黃，南農(nóng)橙乒乓的莖粗顯著大于蒙娜麗莎黃和小洋菊，但與橙安娜無顯著差異；節(jié)間長(zhǎng)表現(xiàn)為蒙娜麗莎黃＞小洋菊＞橙安娜＞南農(nóng)橙乒乓，其中蒙娜麗莎黃和小洋菊無顯著差異，但均顯著高于橙安娜和南農(nóng)橙乒乓；各品種間根系數(shù)均無顯著差異。綜上，4個(gè)菊花品種離體條件下生長(zhǎng)勢(shì)存在明顯差異，具有較好的代表性。

表1 離體培養(yǎng)2個(gè)月4個(gè)菊花品種的形態(tài)指標(biāo)Table1 Morphological indexes of 4 chrysanthemum cultivars cultured for 2 month in vitro

2.2 不同濃度甘露醇對(duì)菊花低溫離體保存的影響

由表2可知，9個(gè)月之前，各品種菊花不同處理間的存活率差異較小，12個(gè)月時(shí)各品種菊花間差異明顯，隨著甘露醇濃度的增加，蒙娜麗莎黃和橙安娜的存活率呈逐漸增加趨勢(shì)，甘露醇濃度為20 g·L-1時(shí)存活率達(dá)到最高，分別為80.00%和93.33%；而小洋菊和南農(nóng)橙乒乓的存活率則隨著甘露醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，且均在15 g·L-1甘露醇處理下存活率最高，分別達(dá)到93.33%和86.67%。

由圖1可知，保存12個(gè)月后，不同品種菊花的綠葉數(shù)變化趨勢(shì)與存活率一致。隨著甘露醇濃度的增加，蒙娜麗莎黃和南農(nóng)橙乒乓綠葉數(shù)量逐漸增多，且在20 g·L-1甘露醇處理時(shí)綠葉數(shù)最多，顯著高于其他處理；而南農(nóng)橙乒乓和小洋菊綠葉數(shù)隨著甘露醇濃度增加，呈先增加后降低的趨勢(shì)，15 g·L-1甘露醇處理下南農(nóng)橙乒乓和小洋菊綠葉數(shù)均達(dá)到最高，生長(zhǎng)狀態(tài)最好。

表2 不同濃度甘露醇對(duì)菊花低溫離體保存存活率的影響Table2 Effect of different concentrations of mannitol on the survival rate of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

綜上，15 g·L-1甘露醇對(duì)南農(nóng)橙乒乓和小洋菊保存效果最好，而蒙娜麗莎黃和橙安娜最適甘露醇濃度為20 g·L-1，保存至12個(gè)月時(shí)，存活率最高，綠葉數(shù)最多。

2.3 不同濃度蔗糖對(duì)菊花低溫離體保存的影響

由表3可知，90 g·L-1高濃度蔗糖處理后的蒙娜麗莎黃、橙安娜和南農(nóng)橙乒乓存活率大幅下降，到保存12個(gè)月時(shí)均降為0，而小洋菊保存6個(gè)月時(shí)的存活率均高于其他3個(gè)品種，12個(gè)月時(shí)存活率仍為26.67%；保存至12個(gè)月時(shí)，蒙娜麗莎黃各處理均已全部死亡，而其他3個(gè)品種存活率隨蔗糖濃度的升高，存活率呈先增加后降低的趨勢(shì)；橙安娜、小洋菊和南農(nóng)橙乒乓分別在45、60和45(和60)g·L-1蔗糖處理下存活率最高，分別為40.00%、73.33%和73.33%。綜上，不同品種菊花離體保存對(duì)高濃度蔗糖耐受性存在差異，且蔗糖處理的存活率低于甘露醇處理。

由圖2可知，保存至12個(gè)月時(shí)各品種菊花不同濃度蔗糖處理綠葉數(shù)均較少。蒙娜麗莎黃已全部死亡；其他3個(gè)品種隨蔗糖濃度的增加，均呈先增加后降低的趨勢(shì)，橙安娜、小洋菊和南農(nóng)橙乒乓分別在45、60和60 g·L-1蔗糖處理下綠葉數(shù)最多。綜上，蔗糖處理下4個(gè)品種菊花離體保存至12個(gè)月后，存活率均較低，且綠葉數(shù)少，植株生長(zhǎng)狀態(tài)差，保存效果較甘露醇處理差。

2.4 菊花組織學(xué)觀察

低溫下保存12個(gè)月后，將20 g·L-1甘露醇處理的蒙娜麗莎黃和橙安娜、15 g·L-1甘露醇處理的小洋菊和南農(nóng)橙乒乓與正常2個(gè)月繼代一次的對(duì)照試管苗相比，組織結(jié)構(gòu)均發(fā)生了變化。具體表現(xiàn)為4個(gè)品種菊花植株葉片厚度變薄，葉肉細(xì)胞變小，細(xì)胞間隙減小，細(xì)胞密度增加(圖3)；且皮層細(xì)胞變小、密度增加(圖4)。

圖1 不同濃度甘露醇對(duì)菊花低溫離體保存綠葉數(shù)的影響Fig.1 Effect of different concentrations of mannitol on number of green leaves of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

圖2 不同濃度蔗糖對(duì)菊花低溫離體保存綠葉數(shù)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of sucrose on the number of green leaves of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

表3 不同濃度蔗糖處理對(duì)菊花低溫離體保存存活率的影響Table3 Effect of different concentrations of sucrose on the survival rate of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

2.5 試管苗恢復(fù)生長(zhǎng)和遺傳穩(wěn)定性鑒定

由表4可知，20 g·L-1甘露醇處理的蒙娜麗莎黃和橙安娜低溫離體保存結(jié)束轉(zhuǎn)移到正常條件下培養(yǎng)可恢復(fù)生長(zhǎng)，恢復(fù)生長(zhǎng)后與CK相比，其植株形態(tài)正常，株高、莖粗、節(jié)間長(zhǎng)、葉片數(shù)量、根系數(shù)等無顯著差異。與CK相比，15 g·L-1甘露醇處理的小洋菊恢復(fù)生長(zhǎng)后其葉片數(shù)和根系數(shù)無顯著差異，而株高和莖粗顯著降低，節(jié)間長(zhǎng)度顯著增加；南農(nóng)橙乒乓節(jié)間長(zhǎng)度顯著增加，其他指標(biāo)無顯著差異。再次繼代培養(yǎng)后這2個(gè)品種菊花植株形態(tài)恢復(fù)正常，與CK相比差異不顯著。

利用選取的5條隨機(jī)引物對(duì)4個(gè)品種菊花再生植株進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，由圖5可知，5條隨機(jī)引物在不同品種間擴(kuò)增帶數(shù)介于6～18之間，4個(gè)品種菊花引物擴(kuò)增總條帶數(shù)分別為61、58、57、61，與對(duì)照相比，均未出現(xiàn)變異條帶。說明低溫離體保存后4個(gè)品種菊花再生植株DNA水平上沒有發(fā)生變化，低溫下離體保存結(jié)束后保持了良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 討論

研究表明，甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可形成滲透脅迫造成細(xì)胞水分與養(yǎng)分吸收困難、新陳代謝減弱，抑制試管苗的生長(zhǎng)從而達(dá)到離體保存效果[19-21]。牛愛國(guó)等[22]研究表明，10 g·L-1甘露醇可使櫻桃試管苗保存7.5個(gè)月的存活率達(dá)62%；蘭偉等[23]研究表明，20 g·L-1甘露醇使香青蘭試管苗保存9個(gè)月的存活率達(dá)40%。本試驗(yàn)在MS培養(yǎng)基中添加15 g·L-1甘露醇可使小洋菊和南農(nóng)橙乒乓試管苗離體保存至12個(gè)月，存活率分別達(dá)93.33%、88.67%，與蝴蝶蘭[24]、甜葉菊[25]的最適甘露醇濃度一致，大于永春蘆柑[26](5 g·L-1)，但低于文心蘭[27](40 g·L-1)，說明不同植物對(duì)甘露醇滲透脅迫適應(yīng)性存在較大差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)添加20 g·L-1甘露醇可使蒙娜麗莎黃和橙安娜試管苗保存至12個(gè)月的存活率分別達(dá)到80.00%和93.33%，但20 g·L-1甘露醇對(duì)小洋菊和南農(nóng)橙乒乓保存效果不佳，試管苗不生長(zhǎng)，葉片緊縮變褐，逐漸死亡。徐志微等[28]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄品種Melissa在50 g·L-1甘露醇的培養(yǎng)基中保存4個(gè)月后存活率可達(dá)65%，而巨玫瑰已經(jīng)全部死亡，表明同種植物不同品種對(duì)甘露醇滲透脅迫適應(yīng)也存在差異。

圖3 低溫離體保存12個(gè)月后菊花葉片組織橫切觀察Fig.3 The cross section of chrysanthemum leaves conserved for 12 months in vitro conservation at low temperature

圖4 低溫離體保存12個(gè)月后菊花莖段組織橫切觀察Fig.4 The cross section of chrysanthemum stem conserved for 12 months in vitro conservation at low temperature

高濃度的蔗糖可通過提高培養(yǎng)基滲透壓，抑制試管苗生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)保存時(shí)間[29-31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，保存至12個(gè)月時(shí)除蒙娜麗莎黃全部死亡外，橙安娜、小洋菊和南農(nóng)橙乒乓分別在45、60和45(和60)g·L-1蔗糖處理下存活率最高，分別為 40.00%、73.33%和73.33%，均高于對(duì)照，但試管苗綠葉數(shù)少，生長(zhǎng)狀況差，效果不及甘露醇處理；而75～90 g·L-1蔗糖使試管苗植株生長(zhǎng)高度減小、節(jié)間長(zhǎng)度縮短，腋芽不萌發(fā)并逐漸變褐死亡，表明已對(duì)植株生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用。研究表明，高濃度的蔗糖對(duì)紀(jì)伊潮野菊[32]、木薯[33]、麥冬[34]等多種植物生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生毒害作用。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小洋菊和南農(nóng)橙乒乓對(duì)高濃度蔗糖的耐性明顯高于蒙娜麗莎黃和橙安娜，表明不同品種對(duì)蔗糖耐性也不同。有研究發(fā)現(xiàn)海棗Bartamoda在60 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基保存至12個(gè)月存活率達(dá)55%，而Sakkoty已全部死亡[35]。不同植物對(duì)蔗糖耐性也不同，如大花卷丹離體保存適宜蔗糖濃度為90～110 g·L-1[36]，東方百合西伯利亞為 60～90 g·L-1[37]。

表4 不同濃度甘露醇處理對(duì)菊花低溫離體保存后再生植株形態(tài)指標(biāo)的影響Table4 Effect of different concentrations mannitol on the morphological indexes of the regenerated plantlets after in vitro conservation at low temperature

圖5 再生植株的SSR分子標(biāo)記圖譜Fig.5 Genetic stability of the regenerated plantlets with SSR

本研究中低溫保存結(jié)束后菊花試管苗的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，具體表現(xiàn)為細(xì)胞變小、細(xì)胞間隙減小、密度增大，與賀川野菊[38]和野生毛葡萄[39]離體保存后的結(jié)果類似，其原因可能是植物細(xì)胞對(duì)低溫和甘露醇形成的滲透脅迫做出的適應(yīng)性反應(yīng)。小洋菊恢復(fù)生長(zhǎng)后，與對(duì)照相比出現(xiàn)株高降低、葉片變小等現(xiàn)象，其原因可能是植株從不良環(huán)境轉(zhuǎn)移至正常條件下生長(zhǎng)，需要一定的適應(yīng)過程，再次繼代培養(yǎng)后植株形態(tài)恢復(fù)正常，與對(duì)照無差異，SSR-PCR擴(kuò)增圖譜也未發(fā)現(xiàn)變異條帶，說明低溫離體保存后再生植株DNA水平上沒有發(fā)生變化，菊花在低溫下離體保存結(jié)束后保持了良好的遺傳穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，7±2℃下 MS培養(yǎng)基添加 15 g·L-1甘露醇對(duì)南農(nóng)橙乒乓和小洋菊試管苗的離體保存效果最佳，而蒙娜麗莎黃和橙安娜在添加20 g·L-1甘露醇處理下效果最佳；相比甘露醇，高濃度蔗糖(45～90 g·L-1)對(duì)試管苗的保存效果不佳。4個(gè)品種菊花經(jīng)低溫加甘露醇處理保存12個(gè)月后，試管苗恢復(fù)正常培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，且保持了良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究結(jié)果為菊花種質(zhì)資源的低溫離體保存提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。