劉文林 張宏紀(jì) 孫 巖 劉東軍 楊淑萍 張 睿 孟慶林

(1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，黑龍江哈爾濱 150086；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)俄農(nóng)業(yè)技術(shù)合作中心，黑龍江哈爾濱 150086；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江哈爾濱 150086)

小麥白粉病(Blumeria graminisf.sp.Tritici)是影響我國(guó)小麥生產(chǎn)安全的主要病害之一，在各小麥主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病后，通常能使產(chǎn)量降低 13%～34%[1]。選育和應(yīng)用抗病品種是防治小麥白粉病害最有效、最經(jīng)濟(jì)的措施[2]。但由于小麥白粉病具有病原菌群體數(shù)量大、生理小種變異快、侵染時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，抗病基因很難保持長(zhǎng)期的高效抗病性，因此，培育并推廣含有多種抗病基因組合型小麥品種是防治白粉病最有效的措施[3]。研究表明，利用與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)小麥抗白粉病基因進(jìn)行輔助選擇和鑒定，有助于加快抗病新品種的培育[4]。

小麥抗白粉病基因是由澳大利亞研究者Waterhouse于1930年首次在小麥品種Thew中發(fā)現(xiàn)的，此后各國(guó)的科學(xué)家在普通小麥、小麥近緣種和小麥近緣屬中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)小麥白粉病抗性新基因，并對(duì)小麥抗白粉病基因的遺傳及染色體定位進(jìn)行了深入的研究[5-7]。如目前已在普通小麥全基因組的54個(gè)基因位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)超過78個(gè)抗白粉病基因，大多數(shù)小麥抗白粉病基因已經(jīng)被分子標(biāo)記和染色體組定位[6]。由于有些基因標(biāo)記檢測(cè)過程復(fù)雜且效率低不能應(yīng)用于育種實(shí)踐，還有待開發(fā)出具有更高利用效率的功能標(biāo)記。目前，育種實(shí)踐上應(yīng)用較多的是基于PCR技術(shù)的Pm2、Pm3、Pm4、Pm8、Pm13、Pm21 等基因的分子標(biāo)記[8-10]，特別是抗性最強(qiáng)、抗譜最廣的Pm21的分子標(biāo)記被廣泛運(yùn)用于國(guó)內(nèi)冬小麥種質(zhì)資源的抗病基因鑒定[11]。

黑龍江省是我國(guó)春小麥主產(chǎn)區(qū)之一，近年來隨著品種、栽培、氣候條件的改變，小麥白粉病有蔓延和加重的趨勢(shì)，對(duì)抗白粉病小麥品種研究也越來越受到人們的重視[5]。目前小麥白粉病是國(guó)家東北春小麥晚熟組品種審定推廣過程中的主要考察病害之一[4]。為闡明黑龍江春小麥抗白粉病基因攜帶類型及其分布現(xiàn)狀，本研究選用連鎖距離相對(duì)較近且穩(wěn)定的Pm2、Pm3、Pm4、Pm8、Pm13、Pm21 等[12-15]抗白粉病基因的序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence tag site，STS)或序列擴(kuò)增區(qū)域(sequence-characterized amplified region，SCAR)分子標(biāo)記，對(duì)黑龍江省生產(chǎn)上推廣種植的123份春小麥品種進(jìn)行抗白粉病基因標(biāo)記檢測(cè)，以期為黑龍江地區(qū)小麥抗白粉病育種相關(guān)的親本組配和多基因聚合提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

黑龍江省春小麥品種123份(建國(guó)以后黑龍江省農(nóng)作物品種委員會(huì)審定推廣小麥品種180余份)，涵蓋省內(nèi)7家育種單位。其中龍輻麥系列20份、龍麥系列10份、克字系列55份、墾紅系列9份、墾大系列8份、東農(nóng)系列11份、墾九與其他墾字系列10份。供試品種數(shù)量占本省所育成品種的65%以上。小麥抗白粉病基因Pm2、Pm3b、Pm4、Pm8、Pm13 和Pm21 的攜帶單個(gè)抗病基因陽性對(duì)照品種分別為Ulka、Sonara/8cc、KHapli/8cc、Kavkaz、R4A 和揚(yáng)麥 5/Sub.6v(由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所孟慶林研究員提供)。

1.2 方法

1.2.1 供試引物 6對(duì)抗白粉病基因的PCR特異引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 小麥抗白粉病基因引物序列表Table1 Wheat powdery mildew resistance gene primer sequence

1.2.2 白粉病調(diào)查 溫室調(diào)查白粉病自然發(fā)病情況(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)溫室，在小麥生長(zhǎng)季節(jié)，溫室內(nèi)15～25℃的溫度和高濕環(huán)境為白粉病發(fā)生創(chuàng)造了理想的條件，白粉病自然發(fā)病情況十分嚴(yán)重，難以控制，即使每月多次使用化學(xué)藥劑防治，少數(shù)感病品種植株葉片上仍有病斑產(chǎn)生，因此，本研究供試品種采取溫室自然發(fā)病鑒定)。根據(jù)葉片的發(fā)病情況，確定小麥抗白粉病抗性級(jí)別為5個(gè)，即1代表高抗(全株無病)，3代表抗病(僅植株基部葉片有少量病斑)，5代表中抗(植株葉片有一些病斑)，7代表感病(植株中上部葉片有較多病斑)，9代表高感(植株全部葉片發(fā)病及穗部也有病斑)，具體抗病級(jí)別按照GB/T 19557.2-2004(小麥新品種DUS測(cè)試指南)[19]進(jìn)行。

1.2.3 DNA的提取 采用CTAB法[7]分別提取各個(gè)供試材料的基因組DNA。為了增加檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每份材料至少提取3株葉片，分別用于檢測(cè)其抗白粉病基因類型。

1.2.4 小麥抗白粉病基因分子標(biāo)記檢測(cè) PCR反應(yīng)體系均為 25 μL:模板 DNA 50 ng，10×buffer 2 μL，dNTP(25 μmol·L-1)0.2 μL，上游和下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U，用無菌蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。PCR采用TC-512 PCR熱循環(huán)儀(Techne，英國(guó))，反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30～60 s，52℃退火45～60 s，72℃延伸 30～90 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用Sub-cel1R Model192高通量電泳槽(Bio-Rad，美國(guó))在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，采用緩沖體系為1×TAE溶液，120V電壓電泳30～50 min，Bio-Rad GEL DocTMEQ凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))照相后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品種抗白粉病標(biāo)記檢測(cè)

利用Mohler等[16]發(fā)表的Pm2基因的顯性STS標(biāo)記對(duì)123份小麥進(jìn)行檢測(cè)，由圖1可知，117份小麥材料擴(kuò)增出一條大小為498 bp的特異性片段，與含有該基因的對(duì)照品種Ulka目標(biāo)條帶相同，說明這些品種含有抗Pm2基因，占所有供試品種的95.1%；而克旱9、克旱19和克豐4等6份材料沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的目標(biāo)條帶，說明不含有抗Pm2基因。

利用Tommasini等[17]發(fā)表的Pm3b基因的顯性STS標(biāo)記對(duì)123份小麥進(jìn)行檢測(cè)，由圖2可知，117份小麥材料可擴(kuò)增出一條大小為721 bp的特異性片段，與含有該基因的對(duì)照品種Sonara/8cc相同，說明這些品種含有Pm3基因，占所有供試品種的95.1%。而其他品種克旱11、克旱14、克旱19、克豐4、墾九9、龍輻麥19沒有該基因。

圖1 部份小麥品種抗Pm2基因檢測(cè)的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis detection of Pm2 gene in wheat cultivar

圖2 部份小麥品種Pm3b基因檢測(cè)的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis detection of Pm3 gene in wheat cultivar

利用劉金元等[8]設(shè)計(jì)的Pm4基因的顯性PCR標(biāo)記對(duì)123份小麥進(jìn)行檢測(cè)，用該標(biāo)記檢測(cè)含有Pm4a和Pm4b基因的對(duì)照品種KHapli/8cc均可檢測(cè)出470 bp特異性片段，而不含有該基因的則無該條帶產(chǎn)生。由圖3可知，所有的供試小麥品種中都沒有擴(kuò)增出與對(duì)照品種相同的特異條帶，表明不含有抗Pm4基因。

利用Francis等[9]開發(fā)的Pm8顯性基因的PCR分子標(biāo)記對(duì)123份小麥進(jìn)行檢測(cè)。含有該基因的對(duì)照Kavkas可擴(kuò)增出一條1.5 kb的特異條帶，反之無條帶產(chǎn)生。由圖4可知，供試的所有小麥品種中，只有龍輻麥17擴(kuò)增出與目的基因相同的特異條帶，說明含有Pm8基因，占所有品種0.8%，而其他品種沒有該基因。

圖3 部份小麥品種Pm4基因檢測(cè)的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis detection of Pm4 gene in wheat cultivar

圖4 部份小麥品種Pm8基因檢測(cè)的電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis detection of Pm8 gene in wheat cultivar

利用Cenci等[10]發(fā)表的SCAR標(biāo)記檢測(cè)Pm13基因，含有該基因的對(duì)照品種R4A可擴(kuò)增出一條564 bp的特異條帶，不含有Pm13基因的材料則不能擴(kuò)增出相對(duì)應(yīng)的特異條帶。由圖5可知，供試的所有小麥品種中，有116份材料能擴(kuò)增出目的基因的特異條帶，說明這些品種含有Pm13基因，占所有品種94.3%。而克旱 19、克豐 4、東農(nóng) 111、北麥 2、北麥 3、龍輻麥 19、龍輻麥20等品種不含該基因。

利用Qi等[18]開發(fā)的SCAR標(biāo)記檢測(cè)Pm21基因，含有該基因的對(duì)照品種揚(yáng)麥5/Sub.6v可擴(kuò)增出1 260 bp特異條帶，反之無條帶產(chǎn)生。由圖6可知，在檢測(cè)的供試小麥品種中，所有的都沒有擴(kuò)增出與目標(biāo)基因相同的特異條帶，說明供試的黑龍江春小麥品種中均不含有抗Pm21基因。

表2 黑龍江省小麥抗白粉病基因檢測(cè)及抗性表型鑒定結(jié)果Table2 Results of wheat powdery mildew resistance gene detection and resistance phenotype identification in Heilongjiang Province

表2(續(xù))

圖5 份小麥品種Pm13基因檢測(cè)的電泳圖譜Fig.5 Electrophoresis detection of Pm13 gene in wheat cultivar

圖6 份小麥品種Pm21基因檢測(cè)的電泳圖譜Fig.6 Electrophoresis detection of Pm21 gene in wheat cultivar

2.2 抗白粉病基因組合在黑龍江省小麥品種中的分布

由表3可知，在黑龍江省123份春小麥品種中小麥抗白粉病基因組合共有8種類型，其中龍麥30、龍麥35、龍輻麥12和龍輻麥18等109份以Pm2/Pm3/Pm13類型所占比例最高，為88.6%；其他7種類型依次為:克旱11和克旱14等3份是Pm2/Pm13類型，所占比例為2.4%；龍輻麥2和龍輻麥7等3份是Pm3/Pm13類型，所占比例為2.4%；東農(nóng)111和龍輻麥20是Pm2/Pm3類型，所占比例為1.6%；北麥2和北麥3是Pm3類型，所占比例為1.6%；龍輻麥19是Pm2類型，所占比例為0.8%；龍輻麥17是Pm2/Pm3/Pm8/Pm13類型，所占比例為0.8%；在克豐4和克旱19小麥中沒有檢測(cè)出上述基因，所占比例為1.6%。

表3 黑龍江省春小麥資源抗白粉病基因組合分布Table3 The distribution of powdery mildew resistance gene composition of spring wheat in Heilongjiang Province resources

2.3 小麥抗白粉病基因組合在黑龍江省不同育種單位之間分布

由表3、表4可知，黑龍江省小麥抗白粉病基因組合存在8種類型，在不同育種單位之間抗白粉病基因組合和數(shù)量存在差異。其中黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所輻射與生物技術(shù)研究室培育的龍輻麥系列品種所含有白粉病基因抗病組合最多，為5種；其次為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院培育的克字系列品種，為4種；黑龍江省農(nóng)墾總局九三科研所培育的墾字系列品種，為3種；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的培育東農(nóng)系列品種為2種；北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司、黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)的墾大系列，黑龍江省農(nóng)墾總局紅興隆科研所的墾紅系列和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種所小麥?zhǔn)业凝堺溝盗械目共』蚪M合類型最少，分別為1種。

表4 小麥抗白粉病不同基因組合在黑龍江省不同育種單位之間的分布Table4 Distribution of wheat powdery mildew resistance gene combinations in different breeding units in Heilongjiang Province

2.4 供試小麥品種白粉病抗性鑒定及其基因組成

供試的123份小麥品種在溫室自然條件下的抗白粉病的表型鑒定發(fā)現(xiàn)(表2)，這些小麥品種的抗性表型分為3種類型，即中抗(抗病等級(jí)為5)、感病(抗病等級(jí)為7)和高感(抗病等級(jí)為9)，不存在抗病(抗病等級(jí)為3)和高抗(抗病等級(jí)為1)類型。由表5可知，72份中抗白粉病品種的基因組成為Pm2/Pm3基因型1份、Pm2/Pm13基因型3份、Pm3/Pm3基因型1份、Pm2/Pm3/Pm13基因型63份、不含有抗病基因2份。28份感白粉病品種中Pm3基因型2份、Pm2/Pm13基因型1份、Pm2/Pm3/Pm13基因型24份、Pm2/Pm3/Pm8/Pm13基因型1份。23份高感白粉病品種中含Pm2基因型1份、含Pm2/Pm3/Pm13基因型22份。

雖然供試的小麥品種有部分表現(xiàn)出中抗水平，但是基本上所有的品種都沒有達(dá)到免疫和高抗水平，說明抗白粉病基因Pm2、Pm3、Pm8、Pm13及其組合對(duì)黑龍江省當(dāng)?shù)匕追鄄∩硇》N的抗病力表現(xiàn)一般，有待引入新的抗白粉病基因。

表5 不同抗白粉病組合在田間抗性分析Table5 Resistance analysis of different resistance to Powdery Mildew in field

3 討論

本研究對(duì)黑龍江省123份春小麥品種白粉病基因進(jìn)行檢測(cè)，得到了抗白粉病基因組成和分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在黑龍江省小麥中，抗白粉病基因Pm2、Pm3和Pm13分布頻率較高，分別為95.1%、95.1%和94.3%，抗白粉病Pm8分布頻率較低，僅為0.01%，而不存在抗白粉病基因Pm4和Pm21，抗病基因類型比較單一；通過在溫室自然條件下的抗白粉病的表型鑒定發(fā)現(xiàn)，不存在高抗和抗病類型，基本都是中抗和高感類型，抗病能力較低。以上結(jié)果與前人對(duì)黑龍江省小麥白粉病菌小種毒性基因頻率進(jìn)行研究時(shí)所得結(jié)果一致[20-21]。陳秀梅等[21]對(duì)黑龍江省春小麥白粉病病菌毒性基因的研究發(fā)現(xiàn)，Pm2毒性基因頻率為27.3%，Pm3b毒性基因頻率為92.4%、Pm4a毒性基因頻率為14.2%、Pm4b毒性基因頻率為12.3%、Pm8毒性基因頻率為100%、Pm13毒性基因頻率為14.2%、Pm21毒性基因頻率為4.5%，相對(duì)應(yīng)的抗白粉病基因抗性依次為Pm21＞Pm4＞Pm13＞Pm2＞Pm3b＞Pm8，說明黑龍江省小麥白粉病總體抗性較低，可能與供試品種攜帶不抗病的Pm3和Pm13基因多，而抗病的Pm21少有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在黑龍江省小麥品種中小麥抗白粉病基因組合共有8種類型，Pm2/Pm3b/Pm13組合所占比例高達(dá)88.6%，其他類型所占比例均較低，抗病組合類型也比較單一，Pm2/Pm3b/Pm3白粉病基因抗性降低，不利于控制白粉病病情，表明黑龍江省內(nèi)小麥育種單位應(yīng)加大力度鑒定新的抗原材料，引進(jìn)Pm4和Pm21等新的、高效的抗白粉病基因。但是引進(jìn)抗白粉病基因的同時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意，即使Pm21被公認(rèn)為白粉病抗性最強(qiáng)、抗譜最廣，但Pm21毒性基因在黑龍江省內(nèi)生態(tài)區(qū)仍有可能發(fā)生，因此，在引進(jìn)使用Pm21抗病基因的同時(shí)，還需引進(jìn)其他類型的抗白粉病基因[22-26]。

供試的123份春小麥品種涵蓋了黑龍江省內(nèi)6家育種單位，審定推廣的小麥品種的主要農(nóng)藝性狀各具特點(diǎn)，分別適應(yīng)于黑龍江省北部高寒冷涼區(qū)(克字系列、墾字系列)、東部濕潤(rùn)區(qū)(墾大系列、墾紅系列、部分龍麥系列)、中、南部早熟干旱高溫區(qū)(部分龍麥龍輻系列、部分墾大系列)三個(gè)生態(tài)區(qū)[27]。雖然所分析的小麥抗白粉病基因組合類型Pm2/Pm3b/Pm13在各育種單位所占比例不同(7%～50%)，但都是以該組合為主要類型，其原因可能與黑龍江省小麥品種演替過程中，為改良品種的銹病抗性，普遍使用高抗銹病的幾個(gè)原始親本有關(guān)[28]。

本研究所檢測(cè)的6個(gè)抗白粉病基因，無論單獨(dú)或組合存在，與小麥白粉病表型抗性的相關(guān)性均不高，說明這些抗病基因?qū)δ壳昂邶埥〈嬖诘陌追鄄∩硇》N無顯著的抗性。但是在分析供試品種的表型抗性時(shí)，發(fā)現(xiàn)感病和高感類型雖有較高的比例(28份＋23份=51份)，實(shí)際上中抗類型所占比例最高(72份)，且都以Pm2/Pm3/Pm13組合為主。說明這部分基因的存在對(duì)小麥品種的白粉病抗性提高有一定的影響，但這種影響比較局限，不存在明顯的規(guī)律(Pm2/Pm3/Pm8/Pm13類型為0.8%，中抗表型無)。這可能與存在其他類型的抗白粉病基因有關(guān)，因此黑龍江省小麥抗白粉病的分子基礎(chǔ)準(zhǔn)確的結(jié)論還需進(jìn)一步更深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，黑龍江省推廣種植的123份小麥品種中含有4種抗白粉病基因，90%以上的品種有Pm2、Pm3和Pm13基因；供試小麥品種的抗性表型主要以中抗、感病和高感類型為主；被檢測(cè)出的4種抗病基因單獨(dú)或其組合存在，供試小麥品種的白粉病抗性沒有達(dá)到抗病以上水平。本研究首次報(bào)道了黑龍江春小麥生態(tài)區(qū)抗百粉病基因及其組成，但是不足之處在于供試小麥材料遺漏了本生態(tài)區(qū)推廣過的約30%的品種，這可能導(dǎo)致某些抗病基因或抗病品種未能被檢測(cè)出來，因此還需要補(bǔ)充其他遺漏品種進(jìn)行抗病表型鑒定和抗病基因分子標(biāo)記檢測(cè)。本試驗(yàn)結(jié)果為篩選黑龍江省小麥抗白粉病抗病品種，引入新的抗病基因及小麥抗白粉病育種提供了理論依據(jù)。