張宇君 王普昶 趙麗麗 曾慶飛 張 雄 陳 超 董 瑞

(1貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系，貴州貴陽 550025；2貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所，貴州貴陽 550006；3貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005)

巴哈雀稗(Paspalum notatum)為禾本科雀稗屬多年生草本植物，又稱百喜草，具有抗干旱、耐貧瘠、覆蓋性好等優(yōu)點[1]。巴哈雀稗被廣泛運用于水土流失治理、荒山荒坡綠化、果園覆蓋、飼草料等[2]，同時因其適應性廣、抗逆性強等特點可作為研究牧草抗逆機理的理想材料，但目前關于巴哈雀稗抗逆機制的相關研究尚未見報道。

植物主要通過信號傳導和轉(zhuǎn)錄因子對一系列抗逆相關基因的網(wǎng)絡進行調(diào)控以抵御逆境脅迫。轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與基因啟動子區(qū)中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)[3]，其能通過與順式作用元件及其他有關蛋白的互相協(xié)調(diào)作用調(diào)控下游一系列基因的轉(zhuǎn)錄[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子種類較多，其中脫水反應元件結(jié)合蛋白(dehydration responsive element binding proteins，DREB)是一類植物特有的與非生物脅迫密切相關的轉(zhuǎn)錄因子，主要分為DREB1和DREB2兩類，隸屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族[5]。DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠與抗性相關基因啟動子中的DRE/CRT(C-repeat)干旱應答元件特異性結(jié)合，并激活下游逆境誘導基因的表達，從而增強植物對逆境脅迫的耐受性[6]。Liu等[7]首次在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆鑒定獲得DREB類轉(zhuǎn)錄因子之后，國內(nèi)外研究者對DREB植物轉(zhuǎn)錄因子相繼開展了廣泛的研究[8-10]。現(xiàn)已從玉米(Zea mays)[11]、小麥(Triticum aestivum)[12]、水稻(Oryza sativa)[13]等多種作物中鑒定分離出DREB/CBF基因，證實了DREB/CBF基因受干旱、鹽堿、溫度、激素等非生物脅迫的誘導表達。楊鳳萍[14]將CBF1基因轉(zhuǎn)入高羊茅(Festuca elata)，DREB1B轉(zhuǎn)入黑麥草(Lolium perenneL.)中，成功獲得了抗旱性增強的轉(zhuǎn)基因高羊茅和黑麥草。Li等[15]將擬南芥CBF1/DREB1b基因以35S為啟動子轉(zhuǎn)入到中華結(jié)縷草(Zoysia sinicaHance)中，明顯提高了其轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性。上述研究表明，通過基因工程技術培育抗逆性較高的草坪草或牧草在生產(chǎn)上具有重要的意義。

本試驗采用RNA-Seq、RT-PCR結(jié)合實時熒光定量PCR方法，以巴哈雀稗為材料克隆獲取DREB2基因序列，并對其在高鹽、干旱、高溫、低溫、脫落酸、赤霉素等逆境脅迫下的表達模式進行分析，以期為闡明雀稗屬植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因家族的作用機理，為進一步通過轉(zhuǎn)基因技術改良巴哈雀稗栽培種的抗逆性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生巴哈雀稗，由貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 將大小均勻一致、籽粒飽滿的巴哈雀稗種子滅菌消毒后，置于墊有兩層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待胚根全部長出且達到種子的二分之一長度后，選取發(fā)芽一致的種子播于帶孔的發(fā)芽床上恒溫培養(yǎng)(光照14 h/黑暗10 h，溫度25±2℃)至三葉一心時進行處理。利用 E-36L植物培養(yǎng)箱(美國PERCIVAL公司)分別進行高溫(40℃)和低溫(4℃)處理 2、4、6、8、10、12、24、48、72 h；在常溫(25℃)下，分別用含有 300 mmol·L-1NaCl、20%PEG-6000、100 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)和100 μmol·L-1赤霉素(gibberellin，GA)的1/2 Hoagland培養(yǎng)液分別處理 2、4、6、8、10、12、24、48、72 h。 以未進行任何脅迫，僅用1/2 Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對照(CK)。每處理均設3次生物學重復。待巴哈雀稗培養(yǎng)至孕穗期后，剪取生長良好的根、莖、葉和幼穗組織，結(jié)穗期獲取籽粒飽滿的種子，以上組織均在剪取時用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取及 cDNA第一鏈合成 采用TRIzol法[16]提取經(jīng) NaCl、PEG-6000、高溫、低溫、ABA、GA脅迫處理下10個不同處理時間段的巴哈雀稗幼苗組織樣品的總RNA，RNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，260/280 nm吸光值測定RNA濃度和純度。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京明陽科華生物科技有限公司)對檢測合格的RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 為獲取巴哈雀稗基因全序列，將未經(jīng)脅迫、正常生長至三葉一心時期的巴哈雀稗幼苗葉片組織RNA樣品送至上海生工生物工程有限公司，采用Illumina HiSeqTM2000進行轉(zhuǎn)錄組雙末端測序。

1.2.4 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因CDS區(qū)克隆 將巴哈雀稗轉(zhuǎn)錄組測序獲取的Unigene結(jié)果與GenBank中已上傳的高粱(Sorghumbicolor)、小麥、割手密(Saccharum spontaneum)等物種的DREB2基因序列進行BLAST比對分析，初步篩選出巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因全序列，并以此為依據(jù)設計巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因CDS區(qū)擴增引物。利用RT-PCR技術，以巴哈雀稗cDNA為模板擴增DREB2基因CDS區(qū)，進一步驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。

克隆擴增體系共 20 μL，包括 2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。 PCR 反應程序:94℃預變性2 min。 94℃變性 30 s，退火溫度(詳見表1)30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸2 min。將切膠純化回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，采用熱激法將載體轉(zhuǎn)入至DH5α感受態(tài)細胞中，恒溫(37℃)培養(yǎng)12～16 h后在Amp＋平板挑取陽性菌落到含氨芐液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 15 h(260 r·min-1，36.5℃)后進行菌體PCR鑒定。合格擴增產(chǎn)物樣送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

通過在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對PnDREB2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析；采用(http://web.expasy.org/protscale/)預測目的蛋白質(zhì)疏水性；采用 SWISS-MODLE(http://swissmodel.expasy.org/)預測目的蛋白的三級結(jié)構；采用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件預測目的蛋白的磷酸化位點；采用Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析目的蛋白的跨膜結(jié)構；采用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析目的基因的亞細胞定位。不同物種DREB2基因氨基酸序列的同源關系采用DNAMAN 6.0軟件分析；應用MEGA 5.1軟件構建不同物種間的系統(tǒng)進化樹。

1.4 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因?qū)崟r熒光定量分析

采用RT-qPCR檢測巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因在不同組織以及不同脅迫處理下葉片組織樣品的表達差異水平。反應條件:2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各 0.4 μL，cDNA 1 μL，用滅菌水補充至總體積為20 μL。反應程序:95℃預變性3 min；95℃變性10 s，退火溫度(詳見表1)30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；退火與熒光采集同時進行，時間為 5 s，溫度范圍為 60～95℃，臺階溫度為0.5℃。對標準品cDNA和待測樣品均設置3次生物學重復，采用2-ΔΔCt法[16]計算基因的相對表達量。

表1 試驗引物序列Table1 Primers sequence used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 巴哈雀稗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝分析

采用Illumina HiSeqTM高通量測序技術對未經(jīng)脅迫處理的巴哈雀稗幼苗葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得42 844 132個reads片段和6.42 GB的序列信息。采用Trimmomatic進行數(shù)據(jù)處理，獲得40 006 430 Clean reads。進一步對序列進行組裝，獲得 99 235個Unigene，平均長度為641.96 bp。

2.2 巴哈雀稗PnDREB2基因克隆鑒定

基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設計巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因CDS區(qū)擴增引物，經(jīng)PCR擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，獲得單一特異性良好的克隆片段，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符。

2.3 生物信息學分析

圖1 PnDREB2的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR amplification of PnDREB2

2.3.1PnDREB2基因及蛋白序列分析PnDREB2基因含有一個連續(xù)完整的開放閱讀框，全長774 bp，編碼257個氨基酸，命名為PnDREB2(登錄號:MH150946)。蛋白分子式為C1210H1916N354O401S8，分子量為28.09 kD，等電點為5.25，谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)在氨基酸序列組成中出現(xiàn)頻率較高，分別占 11.3%、10.1%和 9.7%。巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白含有DREB基因家族典型的AP2結(jié)構域(圖2)。蛋白磷酸化位點預測結(jié)果顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白共含有26個磷酸化位點，分別是13個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、8個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和5個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(圖3)。疏水性分析結(jié)果表明，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白的穩(wěn)定性系數(shù)為46.64，是不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性為-0.694，說明蛋白質(zhì)親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，為親水性蛋白(圖4)。由Signal P 4.1 server軟件預測可知，該蛋白信號肽平均值較小，無切割位點和信號肽，屬非分泌蛋白，說明該蛋白在細胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運。巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白亞細胞定位于細胞質(zhì)中，不具有入核功能，推測其可能主要參與細胞質(zhì)內(nèi)各種蛋白的運輸與組裝。三級結(jié)構預測結(jié)果顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白含有α螺旋結(jié)構和β折疊結(jié)構，相互螺旋，分別位于氨基和羧基末端，折疊為“溝狀”結(jié)構，與目的蛋白結(jié)合良好(圖5)。

圖2 PnDREB2基因保守域Fig.2 Conservative domain of PnDREB2

圖3 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白氨基酸序列翻譯后磷酸化修飾位點預測Fig.3 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of Paspalm notatum DREB2 protein

圖4 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白的親水性/疏水性預測Fig.4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of Paspalm notatum DREB2 protein

圖5 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白質(zhì)三級結(jié)構Fig.5 Tertiary structure analysis of Paspalm notatum DREB2 protein

圖6 巴哈雀稗與其他物種DREB2氨基酸序列比對Fig.6 Comparison of amino acid sequences of DREB2 between Paspalum notatum and other species

2.3.2 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2氨基酸序列比對及構建系統(tǒng)進化樹 將巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白與高粱、割手密、谷子(Setaria italica)、牛鞭草(Hemarthria compressa)、玉米5個具有DREB2同源保守區(qū)的物種基因進行多序列比對，結(jié)果表明不同物種的DREB2氨基酸序列存在高度的保守區(qū)(圖6)。利用MEGA5.1構建進化樹發(fā)現(xiàn)，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2與高粱、割手密、谷子、牛鞭草及玉米位于同一進化分枝上，說明其親緣關系較近，氨基酸序列相似度分別為 91.10%、89.50%、87.6%、87.6%和 88.2%(圖 7)，與梭梭(Haloxylon ammodendron)、擬南芥親緣關系較遠。

圖7 巴哈雀稗PnDREB2氨基酸與其他物種的系統(tǒng)進化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of PnDREB2 of Paspalum notatum and other plants

2.4 PnDREB2基因在不同組織中的表達特性分析

以穗期的巴哈雀稗為材料，利用RT-qPCR技術對PnDREB2基因在巴哈雀稗中的根、莖、葉、幼穗和種子5種組織的基因表達進行分析，由圖8可知，PnDREB2基因在巴哈雀稗的根、莖、葉、幼穗和種子5種組織中均有表達，但各組織的表達量差異顯著，其中在莖中的表達量最高，顯著高于其他組織中的表達量，在幼穗和種子中的表達量均顯著高于根和葉中的表達量，且在葉中的表達量最低，顯著低于其他組織。

2.5 不同脅迫處理下PnDREB2基因時序表達分析

由圖9可知，在不同脅迫處理條件下PnDREB2基因均能夠被誘導表達，且均隨著脅迫時間的延長總體呈先升高后降低趨勢，其中，在NaCl脅迫處理8 h時PnDREB2基因表達量達到峰值，較CK顯著增加了315.00%，24 h與48 h時 表達量較CK分別顯著降低了73.66%和73.89%；在PEG-6000脅迫處理12 h時PnDRER2表達量最高，較CK顯著增加了295.00%，且其他處理時間的表達量均顯著高于CK；40℃高溫脅迫處理10 h時PnDREB2表達量最高，較CK顯著增加了390.83%，且其他處理時間的表達量時間的表達量均顯著高于CK；4℃低溫處理6 h時PnDREB2表達量最高，與CK相比顯著增加了298.33%，除72 h表達量與CK差異不顯著外，其他處理時間的表達量均顯著高于CK；ABA誘導處理10 h時PnDREB2表達量最高，較 CK顯著增加了190.83%，除脅迫8 h時表達量與CK差異不顯著外，其他處理時間的表達量均顯著高于CK；GA誘導處理24 h時PnDREB2表達量最高，較CK顯著增加了181.11%，除72 h時表達量與CK差異不顯著外，其他處理時間的表達量均顯著高于CK。

圖8 PnDREB2基因在巴哈雀稗不同組織中的特性表達Fig.8 Relative expression analysis of PnDREB2 gene in different tissues of Paspalum notatum

圖9 PnDREB2的非生物脅迫及激素誘導差異表達Fig.9 Abiotic stresses and hormone induction of PnDREB2 differential expression profiles

3 討論

Liu等[7]于1998年在擬南芥中首次采用酵母單雜交的方法克隆得到5個DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B)，并表明DREB2A在擬南芥中被干旱和高鹽脅迫強烈誘導表達。近年來，大量研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆性密切相關，尤其在調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的防御過程中發(fā)揮著重要作用[17-19]。本研究采用RNASeq結(jié)合RT-PCR的方法，從巴哈雀稗中成功克隆得到一個DREB家族成員，命名為PnDREB2，同源性和進化樹結(jié)果分析表明，PnDREB2基因的氨基酸序列與高粱、割手密、谷子、牛鞭草以及玉米中DREB2蛋白的氨基酸序列同源性較高，均在87%以上，但與梭梭、擬南芥的同源性較低，進一步證明了不同科屬植物的DREB2基因存在著結(jié)構多樣性。

蛋白序列結(jié)構分析表明，PnDREB2轉(zhuǎn)錄因子含有一個典型的AP2結(jié)構域，而且具有結(jié)構域中第14個位點是纈氨酸、第19個位點為谷氨酸的一級結(jié)構。第14、第19位氨基酸是AP2結(jié)構域中非常保守的兩個位點，對于DREB類轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式作用元件的特異性結(jié)合具有十分重要的作用。另一方面，生物信息學分析顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白含有多個α螺旋和β折疊相互結(jié)構，而且亞細胞定位于細胞質(zhì)中，不具有入核功能。這與肖雄[20]報道的同屬禾本科的紫大麥草中DREB轉(zhuǎn)錄因子定位于細胞核中的研究結(jié)果并不一致。結(jié)構不同，亞細胞定位不同，預示著其生理代謝功能也存在差異[21]。根據(jù)張志飛等[22]對僅含一個AP2/ERF結(jié)構域轉(zhuǎn)錄因子的分類標準，結(jié)合推導的氨基酸序列，PnDREB2轉(zhuǎn)錄因子應屬于DREB2-A2亞類中的亞型1(DREB2A-subtype 1)，因此，該蛋白是一種可調(diào)控逆境應答相關基因表達的蛋白質(zhì)。

Liu等[7]研究認為，在響應逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導過程中，AtDREB2A是一類參與不依賴ABA誘導的信號轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應干旱、高鹽、低溫等逆境的脅迫誘導。而本研究中的基因誘導表達測定結(jié)果顯示，PnDREB2AmRNA表達水平除受干旱、高溫、高鹽和低溫的顯著誘導外，同時也受到ABA不同程度的誘導。因而可以推測，在PnDREB2A轉(zhuǎn)錄因子對基因的表達調(diào)控過程中，存在著不依賴于ABA誘導的信號轉(zhuǎn)導和ABA依賴型表達調(diào)控2種途徑。已有研究證實，ABA信號途徑對DREB2A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要表現(xiàn)在脅迫條件下對DREB2A啟動子的調(diào)控，說明ABA依賴信號途徑和非ABA依賴信號途徑在植物受到脅迫時不是單獨發(fā)揮作用的，在條件需要時可以協(xié)同參與調(diào)控過程[23]。此外，蛋白磷酸化位點預測結(jié)果顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白的磷酸化位點為26個，推測磷酸化也可能是PnDREB2轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控途徑之一。蛋白磷酸化是動植物在逆境脅迫下，提高自我免疫和信號響應的一種重要的自我保護機制。磷酸化作用可以負調(diào)控蛋白質(zhì)對 DNA的結(jié)合活性，磷酸化的DREB2不能結(jié)合DRE元件，而去磷酸化能夠激活下游靶基因的表達[24]，因此，PnDREB2轉(zhuǎn)錄因子通過內(nèi)部的磷酸化與去磷酸化作用參與巴哈雀稗在逆境脅迫下生長應答的信號轉(zhuǎn)導途徑。

植物在逆境脅迫條件下，其相關轉(zhuǎn)錄因子的高效表達能激活多個下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而起到調(diào)節(jié)多個功能基因的作用[25]。魏曉玲等[26]研究表明，在干旱、高溫等逆境脅迫下，DREB類轉(zhuǎn)錄因子能通過與逆境信號途徑中下游基因啟動子區(qū)域的DRE或CRT順式作用元件結(jié)合，激活脫水基因(responsive to dehydration，RD)/冷調(diào)節(jié)基因(cold regulated，COR)類基因的表達，進而增強植物的抗逆性。本研究中，PnDREB2基因的表達量在非生物脅迫和激素誘導處理中隨著處理時間的延長均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，與謝登雷等[27]對高粱的研究結(jié)果一致，說明該基因在植物生長過程中參與了逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導途徑，這與將PnDREB2基因歸于DREB轉(zhuǎn)錄因子A2亞族的結(jié)論相符[28]。組織表達結(jié)果顯示，PnDREB2基因在巴哈雀稗的莖中表達量最高，說明該基因在植物生長過程中可能與物質(zhì)運輸相關。吳國棟等[29]研究大豆DREB基因時發(fā)現(xiàn)，GmDREBc僅在根中受誘導表達；李章磊等[30]對蒙古沙冬青AmDREB2.1基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因主要參與干旱脅迫應答反應，且僅在根中積極響應誘導表達；而本研究中PnDREB2基因主要在莖中強烈表達，與前人研究不一致，其原因可能是不同植物對逆境的感知及在緩解脅迫過程中的響應機制存在差異[31]。目前已有研究報道，在植物DREB的啟動子區(qū)域中還分布有與光、溫度、ABA、GA、茉莉酸、乙烯等相關的順式作用元件，這些元件與對應的反式作用元件發(fā)生作用，共同調(diào)控DREB基因表達水平[32]。綜上，在DREB轉(zhuǎn)錄因子中，不同成員間對不同逆境脅迫的應答存在差異，同時還具有組織特異性表達特征。

4 結(jié)論

本研究從巴哈雀稗中克隆獲得一個的PnDREB2基因，其開放閱讀框全長774 bp，可編碼257個氨基酸，含 DREB基因家族典型的 AP2結(jié)構域，屬于DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因A類中 A2亞類的亞型1。PnDREB2基因在根、莖、葉、幼穗和種子中均有表達，以莖中的表達量最高，表達產(chǎn)物定位于細胞質(zhì)中，并具有26個磷酸化位點。根據(jù)生物信息學和RT-qPCR分析結(jié)果推測，PnDREB2基因參與ABA依賴信號途徑和非ABA依賴信號途徑的協(xié)同調(diào)控，并受到磷酸化蛋白加工水平的調(diào)控，參與高鹽、干旱、高溫、低溫等逆境因子的非生物脅迫響應過程。本試驗結(jié)果為闡明巴哈雀稗不同組織DREB類轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫響應中的作用機理與功能提供了一定的理論依據(jù)。