王 珺，李 曄，張曉勉，高智慧，郭 亮，岳春雷，李賀鵬

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5份桉樹種質(zhì)耐寒性指標(biāo)的測定及其評價(jià)

王 珺1，李 曄2，張曉勉1，高智慧3，郭 亮4，岳春雷1，李賀鵬1

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2.浙江環(huán)科環(huán)境研究院有限公司，浙江 杭州 310007；3.浙江省林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310020；4.臺州市椒江區(qū)農(nóng)林局，浙江 臺州 318000）

以5份桉樹種質(zhì)（鄧恩桉20784，鄧恩桉.99/01，溪谷桉.02/08，鄧恩桉.98/27，柳葉桉.01/19）的離體葉片為試驗(yàn)材料，通過低溫（－7℃）脅迫，測定葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量、半致死溫度（LT50），采用相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析評價(jià)其耐寒性。結(jié)果表明：5份桉樹種質(zhì)的低溫半致死溫度分別為－4.3，－5.31，－3.6，－5.16，－4.73℃。相關(guān)性分析顯示，SOD活性、POD活性、SP含量均與耐寒性呈正相關(guān)，其中SOD活性與耐寒性顯著正相關(guān)（r＝0.982**）；對各指標(biāo)主成分分析表明，SOD活性和POD活性2個(gè)主成分解釋了原變量85.52%的變異信息，根據(jù)綜合指數(shù)的抗寒性排序?yàn)?號鄧恩桉99/01>4號鄧恩桉98/27>1號鄧恩桉20784>3號溪谷桉02/08>5號柳葉桉01/19；通過聚類分析，將5份桉樹種質(zhì)抗寒性劃分為2類，其中耐寒性較強(qiáng)的種質(zhì)是2號和4號，耐寒性較弱的是1號、3號和5號。由此得出結(jié)論：SOD活性和POD活性是反映5份桉樹種質(zhì)抗寒性的兩個(gè)重要指標(biāo)，2號鄧恩桉和4號鄧恩桉為相對耐寒種質(zhì)，更適合浙江生長。

桉樹；耐寒性；生理指標(biāo)；主成分分析；聚類分析

桉樹是桃金娘科Myrtaceae桉屬植物的統(tǒng)稱，為常綠闊葉速生樹種，全世界有900余種，大多數(shù)原產(chǎn)于澳大利亞[1]。桉樹喜溫暖，需強(qiáng)陽光，具有適應(yīng)性較強(qiáng)、生長快等特點(diǎn)，在熱帶、南亞熱帶、中亞熱帶南部等地區(qū)顯示出很高的生產(chǎn)力[2]。但由于桉樹畏寒和對低溫敏感特性，限制了桉樹的向北擴(kuò)展[3]。實(shí)際上，桉樹中有很多優(yōu)良種質(zhì)可以耐受－10℃左右的低溫，近年來，國內(nèi)桉樹界在桉樹北移工作中做了大量的工作，工作重心在引種方面。如河南、湖南、福建、江西贛南地區(qū)等地均開展了耐寒桉樹無性系引種和造林區(qū)域試驗(yàn)及相關(guān)研究[4-8]，取得了較好成效，但在江浙地區(qū)，低溫仍是桉樹引種、擴(kuò)大栽培與速生豐產(chǎn)的主要限制因子，因此有必要對桉樹的抗寒性進(jìn)行研究探討，篩選出適合浙江省建設(shè)速生工業(yè)用材林的桉樹種質(zhì)進(jìn)行推廣，推動桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

據(jù)報(bào)道，桉樹各種類、種源的耐寒性確實(shí)存在明顯的差異，而關(guān)于桉樹耐寒性評價(jià)，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)提出眾多與耐寒性測定有關(guān)的生理生化指標(biāo)，如可溶性蛋白、電導(dǎo)率等[9-10]。由于桉樹的耐寒性是許多數(shù)量或質(zhì)量遺傳基因綜合作用累加的結(jié)果，單一指標(biāo)評價(jià)桉樹耐寒性具有片面性，用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)才較為可靠。本研究通過對5份不同桉樹種質(zhì)葉片超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化物酶（peroxidase, POD）、膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量、可溶性蛋白質(zhì)（soluble protein, SP）含量的研究，運(yùn)用主成分、聚類等分析方法簡化指標(biāo)，初步判定5份桉樹種質(zhì)的綜合得分，并探討這些生理指標(biāo)與植物抗寒性強(qiáng)弱的重要參考指標(biāo)半致死溫度（semi-lethal temperature，LT50）的關(guān)系，為桉樹耐寒指標(biāo)的選擇及耐寒種質(zhì)的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

浙江省林業(yè)科學(xué)研究院于2000年7月引自澳大利亞的5份桉樹種質(zhì)分別為：1號鄧恩桉.20784，2號鄧恩桉99/01，3號溪谷桉.02/08，4號鄧恩桉98/27，5號柳葉桉.01/19，種子引進(jìn)后2013年1月在浙江省林業(yè)科學(xué)研究院大棚進(jìn)行播種育苗，2014年6月將苗木移栽至規(guī)格為20 cm×20 cm的花盆中，每盆栽種l株，每份種質(zhì)栽種30株，以蛭石：珍珠巖：沙（2:2:l，體積比）的混合材料作為栽培基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每3 ~ 5 d澆水1次，以保持土壤濕度。緩苗1個(gè)月后，于2014年7月中旬，每份種質(zhì)選擇生活力強(qiáng)、無病蟲害且長勢一致的小苗各10株，同一種質(zhì)采集當(dāng)年抽梢中下部的正常功能葉40片作為供試材科。

浙江省林業(yè)科學(xué)研究院位于杭州市市郊，120°01′ E，30°13′ N，屬中亞熱帶北部氣候，溫暖濕潤，四季分明，年降水量1 992.5 mm，年蒸發(fā)量1 182.6 mm，年均相對濕度81%。年均氣溫16.5℃，絕對最高氣溫度40.5℃，絕對最低氣溫度－7℃，無霜期240 d。

1.2 測定方法

將供試材料分為3個(gè)重復(fù)（每重復(fù)10片）用蒸餾水沖洗5遍后用紗布擦干，裝入聚乙烯膜中，置于－7℃冰箱中處理24 h后取出進(jìn)行指標(biāo)測定。每份種質(zhì)10片樹葉設(shè)4℃保持24h為對照組（CK）。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[11]；SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[12]；SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）方法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[13]。半致死溫度由電導(dǎo)法測定出相對電導(dǎo)率[14]，再利用Logistic方程=/（1+-bt）計(jì)算得出，其中，為實(shí)測細(xì)胞傷害率；代表冷凍溫度；為細(xì)胞傷害率的飽和容量；，為方程參數(shù)為自然常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2003軟件，計(jì)算各生理指標(biāo)的平均值及平均值與對照組的差值、P值。采用SPSS軟件，進(jìn)行主成分、聚類等相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

選取SOD活性，POD活性，MDA含量和SP含量4個(gè)指標(biāo)對桉樹耐寒性進(jìn)行研究。將5份桉樹種質(zhì)CK組與－7℃處理組各生理指標(biāo)值進(jìn)行分析，差值為處理平均值與對照平均值的差值（表1）。

表1 5份桉樹種質(zhì)生理指標(biāo)值分析

Table 1 Physiological index and analysis of 5germplasm

注：<0.05表示顯著性差異，<0.01表示極顯著性差異。

表1表明，低溫處理后的4項(xiàng)指標(biāo)與對照組之間均存在顯著（<0.05）或極顯著差異（<0.01）。為了對指標(biāo)進(jìn)行分類，找出重要的影響因子，以這4個(gè)指標(biāo)為自變量運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表2和表3。由表2可以看出，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為63.06%和22.46%，其累計(jì)貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到85.52%，表明前2個(gè)主成分基本已包含了全部測量指標(biāo)所具有的信息。表3中，第一主成分在SOD活性，POD活性，SP含量的特征值較大，因此第一主成分可以看作是有SOD活性，POD活性和SP含量構(gòu)成的因子；第二主成分在MDA指標(biāo)上的系數(shù)較大，因此可以看作是由MDA構(gòu)成的因子。

表2 5份桉樹種質(zhì)抗寒性指標(biāo)的特征值及貢獻(xiàn)率

Table 2 The eigen value and contribution rate of cold resistance of 5germplasm

表3 各主成分特征向量

Table 3 The eigen vector of principle components

通過計(jì)算主成分得分（表4）可知，4號和2號桉樹在第一主成分得分較高，說明這兩份種質(zhì)SOD活性，POD活性和SP含量較高，3個(gè)指標(biāo)在調(diào)節(jié)促進(jìn)耐寒性能方面作用較強(qiáng)，兩份種質(zhì)耐寒性較強(qiáng)；5號桉樹在第二主成分上得分較高，說明其MDA含量較高，質(zhì)膜損傷程度較嚴(yán)重，耐寒性較弱。結(jié)合5份桉樹種質(zhì)生理指標(biāo)值進(jìn)行綜合打分（表5），得出5份桉樹種質(zhì)的抗寒性順序依次為2號>4號>1號>3號>5號。

表4 5份桉樹種質(zhì)抗寒性主成分得分

Table 4 Components scores of cold resistance of

表5 5份桉樹種質(zhì)抗寒性綜合打分法計(jì)算

Table 5 The comprehensive scoring method of cold resistance of

2.2 SP含量，MDA含量，SOD活性，POD活性與LT50的關(guān)系

LT50是植物抗寒性強(qiáng)弱的重要參考指標(biāo)，能較好地反映出該植物的抗寒能力。利用Logistic方程計(jì)算得出5份桉樹種質(zhì)的LT50分別為－4.3，－5.31，－3.6，－5.16，－4.73℃（圖1）。

圖1 5份桉樹種質(zhì)的LT50

Figure 1 Semi-lethal temperature of 5germplasm

對SOD活性，POD活性，MDA含量，SP含量和LT50這5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表6。由表6可知，SOD，POD是植物體內(nèi)的內(nèi)源保護(hù)酶系統(tǒng)，具有保護(hù)生物免遭逆境傷害的重要作用。5份桉樹種質(zhì)的SOD活性順序依次為4號>2號>5號>1號>3號，POD活性順序依次為4號>2號>5號>3號>1號，分別與種質(zhì)的抗寒性呈顯著正相關(guān)和正相關(guān)（r＝0.982**，r＝0.681），即種質(zhì)的SOD活性，POD活性越大，其抗寒能力就越強(qiáng)，是反映植物抗寒性的兩個(gè)重要指標(biāo)。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量的變化是質(zhì)膜損傷程度的重要標(biāo)志之一。5種桉樹的MDA含量順序依次為5號>3號>1號>2號>4號，與抗寒性呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.197）。5種桉樹的SP含量順序依次為2號>4號>3號>5號>1號，不同種類的桉樹其葉片SP含量與抗寒性之間存在一定的正相關(guān)（r＝0.726），表明種質(zhì)的抗寒性越強(qiáng)，SP含量越高，但未達(dá)顯著水平。

表6 5份桉樹種質(zhì)各項(xiàng)生理指標(biāo)值之間的相關(guān)系數(shù)

Table 6 Correlation coefficient of physiological index among 5germplasm

2.3 聚類分析

應(yīng)用SPSS軟件上選擇系統(tǒng)聚類法中的組間連接的聚類方法，以SP含量，MDA含量，SOD活性，POD活性和LT50為自變量，對不同種質(zhì)桉樹的抗寒性進(jìn)行聚類分析，輸出聚類分析樹狀圖（圖2）。

圖2 5份桉樹種質(zhì)抗寒性聚類分析

Figure 2 Cluster analysis on cold resistance of 5germplasm

由圖2可以看出，5份種質(zhì)根據(jù)耐寒性可以分為三類：2號和4號為一類，為5份種質(zhì)中相對耐寒的；1號和3號為一類，為5份種質(zhì)種中中等耐寒的；5號為一類，為5份種質(zhì)種中相對不耐寒的。

3 結(jié)論與討論

植物生理過程錯(cuò)綜復(fù)雜，受多種因素影響。SP是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，它們的增加積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起保護(hù)作用[15]。在許多試驗(yàn)中，如關(guān)于核桃，茶的耐寒性研究，抗寒鍛煉期間SP含量與植物抗寒性存在密切關(guān)系[16-17]。本研究表明，5份桉樹種質(zhì)的SP含量與抗寒性呈正相關(guān)性，這與其他的研究結(jié)果也相一致。

正常情況下，植物體內(nèi)的MDA含量極少[18]。在低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞，從而有利于活性氧的產(chǎn)生?；钚匝踹^剩的毒害之一是引發(fā)或加劇膜質(zhì)過氧化的作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損害[19]。MDA含量越高，植物傷害程度就越大。通過本次試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)低溫脅迫后MDA的增量與桉樹的抗寒性之間存在一定負(fù)相關(guān)，即MDA含量高的桉樹種質(zhì)抗寒性弱，反之則強(qiáng)。

許多研究表明，低溫脅迫條件下植物體內(nèi)超常積累活性氧自由基，這些自由基與活性氧的超常積累，對許多生物功能分子有破壞作用[20]。同時(shí)植物細(xì)胞內(nèi)也存在消除自由基的多種途徑，如SOD可以消除O2-，使O2-氧化成為H2O2，而植物體內(nèi)的POD可以進(jìn)一步分解H2O2，使得植物抵抗在逆境脅迫下代謝過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，從而表現(xiàn)出一定的抗逆性[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，SOD，POD活性與植物抗寒性成正相關(guān)，是反映植物抗寒性的兩個(gè)重要指標(biāo)。

影響植物抗寒性的因素是多方面的，如果使用單一指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)分別評價(jià)其抗寒性必定會造成偏差。本試驗(yàn)通過對5份桉樹種質(zhì)SOD活性，POD活性，MDA含量，SP含量和LT50進(jìn)行相關(guān)分析，用主成分分析法并結(jié)合生理指標(biāo)進(jìn)行綜合打分，得出5份桉樹種質(zhì)的LT50由強(qiáng)到弱依次為：2號鄧恩桉99/01>4號鄧恩桉98/27>1號鄧恩桉20784>3號溪谷桉02/08>5號柳葉桉01/19，并通過聚類分析5份桉樹種質(zhì)分為3類，其中2號鄧恩桉99/01和4號鄧恩桉98/27為相對耐寒樹種，為桉樹抗寒性選育和生產(chǎn)發(fā)展提供依據(jù)。

在桉樹抗寒機(jī)理尚未得到充分揭示的情況下，真正反映抗寒性的指標(biāo)還未有一致的看法。本試驗(yàn)只選擇了部分生理指標(biāo)，若要全面鑒定桉樹的耐寒性，應(yīng)選擇多項(xiàng)指標(biāo)（生態(tài)及生理的），供試的材料應(yīng)具有各抗性類型的代表性桉樹種類，在研究時(shí)期的選擇上，應(yīng)對不同樹齡、不同生長季節(jié)的桉樹進(jìn)行取樣分析，并結(jié)合人工低溫處理進(jìn)行綜合分析評價(jià)，才能得到評價(jià)桉樹耐寒性的科學(xué)依據(jù)，更好地挖掘桉樹抗寒種質(zhì)資源，將會是今后研究的重點(diǎn)。

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Determination and Evaluation on Cold Resistance of 5Germplasm

WANG Jun1，LI Ye2，ZHANG Xiao-mian1，GAO Zhi-hui3，GUO Liang4，YUE Chun-lei1，LI He-peng1

（1Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2.Zhejiang Environmental Institute Co.Ltd, Hangzhou 310007, China; 3.Zhejiang Forestry Extension Administration, Hangzhou 310020, China; 4.Taizhou Jiaojiang Agro-forestry Bureau of Zhejiang, Taizhou 318000, China）

Seeds of20784,99/01,02/08,98/27,01/19 were imported from Australia in July of 2000，sowing and seedling was carried out in Hangzhou of Zhejiang in January of 2013.40 leaves were collectedfrom each germplasm and treated by -7℃ and 4℃in July of 2014 for determination of SOD, POD, MDA, SP and LT50.Correlation analysis on determined index demonstrated that SOD, POD and SP had positive relation with cold resistance, especially SOD had significant relation.Principle component analysis indicated that SOD and POD occupied 85.52% of variable.Cold resistance of tested germplasm was ordered by comprehensive index.Cluster analysis concluded that cold resistance of 5 germplasm could be divided into 2 groups.

; cold resistance; physiological index; principal component analysis; cluster analysis

S792.39

A

1001-3776（2018）05-0045-06

2017-12-16；

2018-05-13

浙江省省屬科研院所專項(xiàng)項(xiàng)目（2017F30016）；浙江省林業(yè)廳林業(yè)推廣項(xiàng)目（2012B09）；臺州市農(nóng)業(yè)類一般項(xiàng)目（162hb02）

王珺，助理研究員，從事濕地生態(tài)研究；E-mail：47935927@qq.com。

張曉勉，副研究員，從事植物抗逆研究；E-mail：82236545@qq.com。

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.05.008